大規(guī)模翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學研究進展

大規(guī)模翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學研究進展

翻譯蛋白質(zhì)后的精煉是指對基因功能的實現(xiàn)過程，它通過添加或添加氨基酸殘基，或通過蛋白質(zhì)水處理改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)。短暫氨基酸處理不僅是“裝飾”，還調(diào)節(jié)了蛋白質(zhì)的活性狀態(tài)、定位、折疊和蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用。盡管蛋白質(zhì)的翻譯后修飾對生物功能的發(fā)揮有著至關(guān)重要的作用,但對它的規(guī)模化研究受到分析方法的限制,這很大程度上是由于翻譯后修飾蛋白質(zhì)的化學計量值低、復雜性大造成的.基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA的可變剪接以及翻譯中和翻譯后修飾導致了基因產(chǎn)物的多樣性,據(jù)預測,人類基因組包含大約30000個開放閱讀框,平均每1個可閱讀框可產(chǎn)生5~6個不同的mRNA,每1個mRNA翻譯生成的蛋白質(zhì)以不同的方式進行加工,每個多肽鏈大約可產(chǎn)生8~10種不同的修飾.目前,記錄在冊的翻譯后修飾超過400種(/index.cfm/dm.home),仍有新的翻譯后修飾被發(fā)現(xiàn).同時,翻譯后修飾還存在時空特異性,蛋白質(zhì)的修飾類型及修飾程度隨生物生存環(huán)境及內(nèi)在狀態(tài)的變化會表現(xiàn)出極大的差別,有的修飾甚至是轉(zhuǎn)瞬即逝的,所以,蛋白質(zhì)翻譯后修飾的程度以及其生物學功能的挖掘還存在著極大的空間.面對紛繁復雜的翻譯后修飾,應運產(chǎn)生了modification-specificproteomics:詳細、系統(tǒng)地研究蛋白質(zhì)翻譯后修飾的蛋白質(zhì)組策略.基于翻譯后修飾蛋白質(zhì)的不均一性及相對豐度低的特性,翻譯后修飾蛋白質(zhì)的研究主要是利用現(xiàn)有的蛋白質(zhì)組學技術(shù)體系包括電泳、色譜、生物質(zhì)譜以及生物信息學工具,對修飾蛋白質(zhì)或肽段進行富集分離,消除修飾引起的不均一性并質(zhì)量標記修飾位點,使之與理論質(zhì)量有一個差異,通過質(zhì)譜檢測這種差異,從而鑒定蛋白質(zhì),并通過串聯(lián)質(zhì)譜鑒定修飾位點.其中存在的問題主要有兩個:即翻譯后修飾蛋白的富集分離問題和二級質(zhì)譜的裂解效率問題.目前廣泛使用的肽段裂解技術(shù)包括碰撞誘導解離(CID)和源后衰變(PSD)兩種,某些翻譯后修飾(如糖基化、磷酸化)在此條件下會優(yōu)先斷裂而使主鏈的裂解受到抑制,降低修飾位點的鑒定成功率.雖然翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學技術(shù)條件還不完備,但是,隨著蛋白質(zhì)組表達譜研究技術(shù)的日益成熟和規(guī)?；?翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)已經(jīng)取得了可喜的進展.1磷酸化蛋白質(zhì)組的分離富集蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是生物體內(nèi)最重要的共價修飾方式之一.在人類蛋白質(zhì)組研究中,據(jù)估計,超過50%的蛋白質(zhì)發(fā)生過磷酸化修飾,估計有100000個潛在的磷酸化位點.目前,磷酸化蛋白質(zhì)組的研究主要集中在真核生物體內(nèi)普遍存在的絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸磷酸化.由于在生物體內(nèi)磷酸化修飾蛋白質(zhì)的含量非常低,因此在分析前必須要采取一定的分離富集手段.目前,磷酸化蛋白質(zhì)的常用分離富集技術(shù)包括:金屬親和磷酸化蛋白質(zhì)/磷酸化肽段(IMAC)、免疫沉淀、強陽離子交換色譜(SCX)、強陰離子交換色譜(SAX)、反相色譜等,這些技術(shù)被整合優(yōu)化并應用于不同生物樣本的磷酸化蛋白質(zhì)組分析中.1.1全面研究絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的策略1.1.1分離步驟多的檢測Beausoleil等測定了HeLa細胞的細胞核磷酸化蛋白質(zhì)組.細胞核蛋白質(zhì)經(jīng)制備型SDS預分離后,胰酶酶切,在pH2.7下進行SCX分離,再經(jīng)反相色譜、LCQ離子阱三級質(zhì)譜鑒定,得到了2000多個磷酸化位點.用同樣的技術(shù)路線研究胚胎鼠腦的磷酸化蛋白質(zhì)組,鑒定了近500多個磷酸化肽段.雖然沒有采用任何富集方法,此路線鑒定磷酸化肽段的能力卻是驚人的;但是該方法仍有缺陷:含有超過2個堿性氨基酸殘基的磷酸化肽段會與非磷酸化肽段共洗脫,無法被檢測到;由于分離步驟多,所需樣品量大;分離得到的餾分多,需要大量的分析時間.Gruhler等采用SCX和IMAC結(jié)合的方法對酵母信息素信號通路的磷酸化蛋白質(zhì)進行研究,同時采用細胞培養(yǎng)物中氨基酸的穩(wěn)定同位素標記對磷酸化蛋白質(zhì)進行定量,LTQ-FTICR三級質(zhì)譜鑒定得到了大約700個磷酸化肽.Collins等采用4條技術(shù)路線對小鼠的突觸體磷酸化蛋白質(zhì)組進行研究,其中一種路線采用兩次固相金屬親和的方法.作者認為,雙金屬親和的方法鑒定的磷酸肽具有互補性,可以檢測到不同豐度范圍和不同磷酸化狀態(tài)的磷酸化蛋白質(zhì).文獻、采用了IMAC-LC-MS/MS的技術(shù)路線進行磷酸化位點的鑒定,兩者都對甲酯化反應進行優(yōu)化,肽段經(jīng)甲酯化反應處理后再進行IMAC親和,并且均增大了親和柱的柱床體積.在進行重復性實驗時,兩者均發(fā)現(xiàn)不同批次之間的覆蓋率大約為60%.作者認為,未重復鑒定的肽段是由于質(zhì)譜的掃描模式(information-dependentacquisitionmode)所限.在磷酸化蛋白質(zhì)/肽段的富集方法中,IMAC是最頻繁應用的方法,也是最行之有效的方法之一.但是,該方法仍有一定的缺陷:通過IMAC親和,主要富集得到多電荷的磷酸化肽段,而且酸性較強的非磷酸化肽段會共洗脫.目前,酯化法以及二氧化鈦親和法已被發(fā)展用于降低親和富集方法對酸性肽段的非特異性吸附.1.1.2磷酸化蛋白質(zhì)的檢測基于非液相色譜的磷酸化蛋白質(zhì)組研究相對較少.Yamagata等結(jié)合二維電泳和磷酸酶對小鼠表皮纖維原細胞的磷酸化蛋白質(zhì)進行觀測.作者對電泳結(jié)果進行分析發(fā)現(xiàn),1315個凝膠點中有63個點的位置向堿性端發(fā)生偏移.選擇20個豐度較高的點進行Q-TOF鑒定,結(jié)果17個已有文獻報道為磷酸化蛋白質(zhì).Hayduk等采用一種可專門針對磷酸化蛋白質(zhì)進行染色的熒光染料Pro-QDiamond并結(jié)合雙向電泳對中國倉鼠卵細胞的磷酸化蛋白質(zhì)進行了觀測,在1877個總蛋白點中“看”到了672個磷酸化蛋白質(zhì)點,約占總蛋白質(zhì)的36%.1.2酪氨酸磷酸化蛋白及抗體的選擇在真核生物常見的三種磷酸化形式中,絲氨酸磷酸化最多,蘇氨酸磷酸化其次,酪氨酸磷酸化最少,三者的比例約是1800∶200∶1.由于酪氨酸磷酸化抗體的選擇性、特異性最好,因此,酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)組的研究主要是基于抗體的高度靈敏性及特異性進行的.Salomon等采用酪氨酸磷酸化抗體免疫沉淀,結(jié)合甲酯化固相金屬親和色譜富集磷酸肽策略,研究了T細胞受體信號通路中的酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì).同時,還研究了慢性骨髓性白血病細胞用STI571(Gleevec)處理后BCR-ABL信號通路中的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化位點的變化.Blagoev等結(jié)合多種蛋白質(zhì)組學策略,對HeLa細胞酪氨酸磷酸化依賴的信號網(wǎng)絡(luò)進行研究,作者采用精氨酸的3種穩(wěn)定同位素形式對HeLa細胞進行代謝標記,對不同標記的細胞分別刺激不同的時間,再將細胞混合,用免疫沉淀的方法提取酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì),酶解后的肽段進行LC/MS/MS分析.結(jié)果發(fā)現(xiàn),共有81個蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化出現(xiàn)表達差異.Rush等通過酪氨酸磷酸化抗體免疫沉淀磷酸肽,與傳統(tǒng)認為的磷酸化蛋白質(zhì)抗體不適合富集磷酸化肽相悖,作者鑒定了多種瘤細胞中的總計688個酪氨酸磷酸化肽段,其中628個肽段有位點信息,這也是迄今鑒定細胞酪氨酸磷酸化最多的研究.由于絲氨酸、蘇氨酸磷酸化抗體的特異性受空間位阻影響,其特異性遠遠不如酪氨酸磷酸化抗體,基于免疫親和的絲氨酸、蘇氨酸磷酸化研究較少.1.3質(zhì)譜鑒定難在規(guī)?；牧姿峄鞍踪|(zhì)鑒定中,ESI-QTOF-MS、線性離子阱質(zhì)譜儀使用較多.DeGiorgis等采用LCQ質(zhì)譜儀,對磷酸化蛋白質(zhì)肽段的二級質(zhì)譜圖進行了分析,并對出現(xiàn)的問題加以解析:1)大多數(shù)譜圖包含強的中性丟失離子峰,但也有未出現(xiàn)中性丟失離子峰的譜圖.這些譜圖可能是非磷酸肽或酪氨酸磷酸肽對應的譜圖.2)單電荷肽段離子未被鑒定到,僅有2個四電荷肽段離子被鑒定到,可能是由于單電荷肽段的二級譜圖過于簡單、四電荷肽段的二級譜圖太復雜,以至于SEQUEST軟件難以識別.3)在線性離子阱質(zhì)譜中,由于氣相β-消除反應的競爭,肽鍵不易斷裂,導致一些譜圖中雖有強的中性丟失離子峰,但沒有足夠的碎片離子峰進行磷酸化位點的指認.為了進一步對這些位點加以確認,作者又做了三級質(zhì)譜,可能由于樣品中多磷酸化肽段的豐度較高,三級譜圖也出現(xiàn)同樣的問題.Moser等比較了QSTAR(ESI-QTOF-MS)和LTQ(線性離子阱)兩種質(zhì)譜儀,認為QSTAR比LTQ更適合磷酸肽的序列分析.一方面由于QSTAR的高壓、高碰撞效率的內(nèi)腔,肽段裂解效率更高,更易發(fā)生中性丟失峰,另一方面由于飛行時間質(zhì)量分析器的高分辨、高質(zhì)量精確度,利于電荷狀態(tài)的確認,減少假陽性.然而,由于LTQ的采集速率很高,而且可以做三級質(zhì)譜,在一定程度上可彌補自身的缺點.在進行質(zhì)譜鑒定時,磷酸化位點的指認困難是一個常見問題,這可能是由于軟件沒有考慮β消除反應產(chǎn)生的新型離子的存在.2糖基化的不均一性根據(jù)氨基酸和糖鏈的連接方式不同,蛋白質(zhì)糖基化可分為4類:N-糖基化、O-糖基化、C-甘露糖化和聚糖磷脂酰肌醇錨(GPI-anchor)糖基化.蛋白質(zhì)糖基化的一個重要特點是不均一性,即不同的糖鏈可連于同一位點以及在同一蛋白質(zhì)上也可有不同的位點連接不同的糖鏈.糖基化的不均一性給糖蛋白質(zhì)的分離分析帶來了很大的困難:不同糖型的同一蛋白質(zhì)會在電泳上呈現(xiàn)彌散的條帶,導致信號分散,較低豐度的蛋白質(zhì)得不到鑒定;造成糖蛋白質(zhì)在色譜中不能良好的分離;在質(zhì)譜上表現(xiàn)為一簇分辨率很差的峰,得不到準確的分子量.鑒于此,當前國際上的主要研究策略是利用現(xiàn)有技術(shù)體系,分離富集糖蛋白質(zhì)/糖肽,消除糖基化的不均一性及其對質(zhì)譜的影響,質(zhì)量標記糖基化位點,從而揚長避短,實現(xiàn)大規(guī)模高通量糖蛋白質(zhì)及糖基化位點的鑒定.目前,常用的糖蛋白質(zhì)分離富集技術(shù)有:凝集素親和技術(shù)、肼化學富集法、親水相互作用色譜法、β消除麥克爾加成反應.基于質(zhì)譜的糖蛋白質(zhì)鑒定及糖基化位點確定方法有:PNGaseF酶法、EndoH酶法、β-消除麥克爾加成反應、三氟甲基磺酸法.后兩種方法未見用于規(guī)?；堑鞍踪|(zhì)分析的相關(guān)報道.2.1凝集素親和技術(shù)基于糖蛋白質(zhì)本身的復雜性,在糖蛋白質(zhì)組的研究中必須運用多元化的技術(shù)和策略.Hagglund等在對人血漿糖蛋白質(zhì)進行研究時采用凝集素親和與親水相互作用色譜相結(jié)合的方法,EndoH酶法切糖,從而在N-糖基化位點處留下GlcNAc起到質(zhì)量標記的作用,用ESIQ-TOF質(zhì)譜鑒定得到37個蛋白質(zhì)的67個糖肽.Bunkenborg等采用兩步凝集素親和的方法分別富集糖蛋白質(zhì)和糖肽,采用PNGaseF酶法使天冬酰胺轉(zhuǎn)變?yōu)樘於彼?造成質(zhì)量數(shù)增加0.98Da,用LCQ離子阱質(zhì)譜鑒定出人血清中77個糖蛋白質(zhì)中86個糖基化位點.Kristiansen等把凝集素親和法與一維凝膠電泳相結(jié)合對人膽汁進行研究,在使用PNGaseF進行切糖時,采用18O的水進行標記,造成質(zhì)量數(shù)增加3Da,這種方法減少了由于自發(fā)脫氨基帶來的假陽性.Liu等在對人血漿N-糖蛋白質(zhì)進行研究時,先采用免疫親和的方法去除血漿中的高豐度蛋白質(zhì),再用肼化學法富集糖基化蛋白質(zhì),柱內(nèi)酶解蛋白后,使用PNGaseF釋放N-糖肽,經(jīng)SCX分離,通過反相毛細管色譜-LTQ離子阱串聯(lián)質(zhì)譜對糖肽進行分析.同時,作者采用FTICR對鑒定的糖基化位點的可靠性進行評估,總共鑒定了303個N-糖蛋白質(zhì)的2053個N-糖肽,有639個N-糖基化位點被確認.目前,凝集素親和技術(shù)是糖蛋白質(zhì)組學中應用最廣的分離富集技術(shù),肼化學法由于其高特異性也受到越來越多的關(guān)注,上述報道也是目前肼化學法應用最成功的例子.2.2糖基化離子標記對于O-糖蛋白質(zhì)來說,現(xiàn)在還沒有一種能與N-糖蛋白質(zhì)研究中應用的PNGaseF相比的一種酶用以實現(xiàn)去糖基化及質(zhì)量標記糖基化位點,因而O-糖蛋白質(zhì)組學的研究鮮有報道.Khidekel等采用體外標記方法將一個帶有酮基的UDP-半乳糖特異地連接到O-GlcNAc上,然后利用酮基的反應性與生物素連接,進而通過抗生物素蛋白富集糖基化蛋白質(zhì).這種標記方法不依賴于生物體自身代謝途徑,大大擴展了方法的適用范圍,用這種方法Khidekel等從鼠腦中鑒定了25個O-GlcNAc化蛋白質(zhì).Vosseller等采用凝集素弱親和色譜的方法對鼠腦突觸后密集區(qū)的O-GlcNAc蛋白質(zhì)進行研究,通過凝集素對O-GlcNAc肽段的弱親和作用,延長了對含O-GlcNAc肽段的保留時間,其實質(zhì)相當于離子交換色譜的作用,與高效液相色譜連用,ESI-QqTOF-MS鑒定了63個O-GlcNAc肽段.該方法的優(yōu)點是可直接富集體內(nèi)的O-GlcNAc化蛋白質(zhì),無需對糖基化位點進行化學或酶解標記的改造,方法簡單.同時,作者還采用了電子捕獲裂解(electroncapturedissociation,ECD)對O-GlcNAc化位點進行分析.這也是目前ECD首次運用于復雜樣品的修飾位點分析,共鑒定了12個O-GlcNAc化位點.ECD是存在于傅立葉轉(zhuǎn)換離子回旋共振質(zhì)譜儀中的新型蛋白/肽段裂解方式,在ECD條件下,翻譯后修飾甚至非公價鍵維系的二級結(jié)構(gòu)都可保持穩(wěn)定,使得ECD成為非常有前途的翻譯后修飾研究工具.2.3gpi-aps的制備聚糖磷脂酰肌醇錨定蛋白質(zhì)(Glycosylphosphatidylinositol-anchoredproteins,GPI-APs)是由聚糖磷脂酰肌醇基團共價連接于蛋白質(zhì)的C末端形成,由于錨定于脂雙層而具有固有膜蛋白質(zhì)的一些物理化學特性.對GPI-APs的主要研究方法是采用“shave-and-conquer”的策略,該方法采用兩相分離法,在溶有細胞膜的有機相中加入磷脂酰肌醇磷脂酶C(PI-PLC,phosphatidylinositolphospholipaseC)水解磷脂酰肌醇,GPI-APs被釋放而溶入水相,結(jié)合一維或二維凝膠電泳分離、免疫印跡檢測、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對蛋白質(zhì)進行鑒定.Borner等同時采用差減蛋白質(zhì)組學的策略,對經(jīng)PI-PLC處理和未經(jīng)PI-PLC處理的樣品的水相蛋白質(zhì)進行二維熒光差示凝膠電泳分離,由于污染蛋白質(zhì)在2個組分中共同存在,將相同的蛋白質(zhì)剔除后便得到純的GPI-APs.3gly-gly串聯(lián)質(zhì)譜鑒定泛素化位點泛素是由76個氨基酸組成的多肽,高度保守,可通過異肽鍵與靶蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基的ε氨基共價連接.從酵母到哺乳動物,泛素化都是細胞蛋白質(zhì)降解和功能調(diào)控中非常重要的調(diào)控機制,重要性甚至可以與磷酸化相當.對泛素化修飾的研究應包括以下幾個方面:1)哪些蛋白質(zhì)被泛素化修飾?2)泛素結(jié)合在蛋白質(zhì)的什么位點?3)自然發(fā)生的多聚泛素化鏈中泛素-泛素結(jié)合位點在哪里?4)泛素-蛋白酶系統(tǒng):鑒定調(diào)節(jié)泛素和類泛素系統(tǒng)的酶體系構(gòu)成.對泛素化蛋白質(zhì)富集主要是基于標記法進行的,即對泛素進行親和標簽標記(常用6xHis),再采用鎳螯合色譜親和提取泛素化蛋白質(zhì).由于泛素的C末端是Arg-Gly-Gly結(jié)構(gòu),經(jīng)胰蛋白酶水解后,Gly-Gly留在被修飾蛋白質(zhì)的肽鏈上,使肽段質(zhì)量增加114,起到質(zhì)量標記泛素化位點的作用,進而通過串聯(lián)質(zhì)譜鑒定泛素化位點.Peng等運用此方法,再結(jié)合SCX、RP-LC分離泛素化肽段,通過LCQ串聯(lián)質(zhì)譜鑒定酵母中的1075個泛素化蛋白質(zhì),110個泛素化位點.這種方法已經(jīng)被延伸運用到了哺乳動物體系的泛素化研究中.近來,基于雙親和策略的富集方法頻繁出現(xiàn),Mayor等采用多聚泛素結(jié)合柱與鎳螯合色譜相結(jié)合,對酵母中Rpn10依賴的泛素化蛋白質(zhì)進行鑒定;Tagwerker等則采用基于雙標記的雙親和富集策略,對泛素基團進行六組氨酸標簽標記和生物素標簽標記,然后依次采用鎳螯合色譜、鏈霉抗生物素蛋白親和提取泛素化蛋白質(zhì),同時針對富集方法中鏈霉抗生物素蛋白的緊密折疊特性采用兩步酶解的方法(Lys-C、trypsin)從柱上洗脫、酶解泛素化蛋白質(zhì),結(jié)合SCX、RP-LC色譜分離,QSTAR質(zhì)譜鑒定到258個泛素化蛋白質(zhì).目前,對泛素蛋白的研究已從真核細胞體系延伸到哺乳動物體系中,對泛素的標記方法也有所發(fā)展,像璜酸化,現(xiàn)在該方法還停留在標準蛋白的試驗階段,在規(guī)模化的泛素化蛋白鑒定中的應用還未見報道.對泛素自身的修飾位點的研究.目前,在酵母體系中,基于鳥槍法的大規(guī)模泛素化蛋白質(zhì)的研究已經(jīng)表明,泛素中的7個賴氨酸側(cè)鏈均可形成多聚泛素鏈,以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學開始為多聚泛素鏈的分析提供一種直接的可定量的方法.多蛋白復合體以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用在泛素-蛋白酶體系中承擔了重要的角色,運用親和純化與質(zhì)譜相結(jié)合的方法,多種細胞和組織中的去泛素化蛋白酶已被鑒定,并且鑒定出許多新的去泛素化系統(tǒng)成員.總之,現(xiàn)有的泛素化蛋白規(guī)?；芯糠椒ê苌?且種類單一,鑒定細胞蛋白的泛素化底物,泛素化位點及泛素自身的修飾位點,還需要有重大的技術(shù)上的進步.除了泛素化修飾之外,還發(fā)現(xiàn)了一大家族——類泛素化修飾.類泛素化與泛素化具有顯著的序列同源性,許多情況下通過相似的機制形成蛋白質(zhì)的共價修飾.目前,許多與泛素化修飾相似的研究方法運用到了Sumoylation(類泛素化修飾的一種)的研究中.4蛋白質(zhì)功能的長期喪失活性氧和氮類可以對特定蛋白質(zhì)進行各種各樣的化學修飾,如果這種修飾是不可逆的,則經(jīng)常與蛋白質(zhì)功能的永久喪失相關(guān),可以導致?lián)p害蛋白質(zhì)的消除或積累;可逆修飾,特別是發(fā)生在半胱氨酸殘基上的,可以起到保護半胱氨酸避免發(fā)生不可逆氧化修飾和調(diào)節(jié)蛋白功能的雙重作用.在這里,我們對已有的基于蛋白質(zhì)氧化還原狀態(tài)進行研究的蛋白質(zhì)組學進行介紹.4.1酪氨酸硝化抗體一般說來,硝化是在酪氨酸殘基的酚環(huán)的3位上加上1個硝基(—NO2),是細胞內(nèi)過氧化亞硝酸根離子(—ONOO-)形成的結(jié)果.目前,大部分的酪氨酸硝化的蛋白質(zhì)組研究是在某種刺激條件下,以酪氨酸硝化抗體為基礎(chǔ)進行的.Aulak等研究與炎癥相關(guān)的硝化蛋白質(zhì),采用二維電泳與免疫印跡相結(jié)合的方法,MALDI-TOF-MS鑒定了40多個酪氨酸硝化免疫陽性的蛋白質(zhì),其中10多個已被鑒定過.Kanski等采用連續(xù)的溶液等電聚焦進行樣品體系的簡化,再對粗分離的組分進行SDS分離、免疫印跡檢測,目標蛋白質(zhì)經(jīng)LC-LCQ串聯(lián)質(zhì)譜分析鑒定出11個硝化蛋白質(zhì).4.2f間基本思想S-亞硝?；?也叫做S-亞硝化,是在硫原子上加上一個亞硝基雙原子基團(—NO).對S-亞硝酰化蛋白質(zhì)的研究策略主要是以“biotin-switch”方法為基礎(chǔ)的,該方法最早由Jaffrey等提出,大致包括以下幾個步驟:(1)封閉所有自由巰基;(2)選擇性還原S—NO鍵;(3)還原產(chǎn)生的新的自由巰基通過形成雜和的二硫鍵引入生物素標簽,從而對蛋白質(zhì)進行了質(zhì)量標記以及親和標記;(4)通過固相的抗生物素蛋白富集目標蛋白質(zhì).這種方法克服了直接對亞硝化蛋白質(zhì)進行分析時產(chǎn)生的易變性,避免了進行質(zhì)譜鑒定時產(chǎn)生的S—NO的斷裂.許多研究運用這種方法與一維凝膠電泳或二維凝膠電泳相結(jié)合,再通過質(zhì)譜鑒定發(fā)生亞硝?；牡鞍踪|(zhì).Hao等對該方法進行了發(fā)展,先用胰酶把蛋白質(zhì)酶解再進行抗生物素蛋白富集,然后結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進行蛋白質(zhì)鑒定.4.3谷胱甘肽酶活性蛋白的檢測谷胱甘肽化(glutathionylation)即谷胱甘肽(GSH)在谷氧還蛋白酶的催化下與蛋白質(zhì)的半胱氨酸形成二硫鍵,該過程是可逆的.Lind等采用與S-亞硝酰化相似的分析方法,在生物素標記蛋白富集前對蛋白進行酶解,富集谷胱甘肽化肽段,從而鑒定到發(fā)生修飾的位點.人們發(fā)現(xiàn),日本裂體吸蟲分泌的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶可以結(jié)合S-谷胱甘肽化蛋白的谷胱甘肽簇.基于此,Cheng等將谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶用生物素標記后,采用一種類似免疫印跡的方法檢測谷胱甘肽化蛋白,這為谷胱甘肽化蛋白質(zhì)的檢測提供了一種簡便易行的方法.由于S-亞硝化谷胱甘肽(GSNO)也是一種GS-供體,可以與蛋白質(zhì)形成雜和的二硫鍵,因而Klatt等把GSNO與瓊脂糖凝膠相結(jié)合,通過GSNO柱來結(jié)合目標蛋白質(zhì),但這種方法不能反映體內(nèi)實際發(fā)生谷胱甘肽化修飾的蛋白質(zhì)情況,只能檢測那些易受谷胱甘肽化影響的蛋白質(zhì).4.4氧化還原修飾的探索半胱氨酸在氧化條件下可形成二硫鍵、亞氧硫基(—SOH)、亞硫酸基(—SO2H)、硫酸基(—SO3H),其中亞硫酸基和硫酸基是半胱氨酸的不可逆氧化形式,可能與生物活性的喪失有關(guān).為了系統(tǒng)地研究細胞的氧化還原調(diào)節(jié),Yano等采用硫醇特異的熒光標記,并結(jié)合兩種類型的雙向電泳(non-reducing/reducing2-DE和IEF/SDS),成功鑒定到花生中受硫氧還蛋白調(diào)控的20多個蛋白.Lee等對一種植物中含有二硫鍵的蛋白質(zhì)進行了研究,采用硫醇親和色譜富集目的蛋白,共鑒定到65個公認的含二硫鍵的蛋白.Moan等則采用雙標記的方法對啤酒酵母中的硫醇氧化蛋白分別進行富集和定量,總共質(zhì)譜鑒定了64個蛋白質(zhì).總之,對氧化還原修飾的研究還處于初始階段,大部分的研究工作是基于MALDI-TOF的蛋白質(zhì)鑒定,對修飾位點的研究很少.相信隨著科學家們越來越多的關(guān)注,會有更多更有效的方法出現(xiàn),從而能更深刻地理解氧化還原修飾的功能.5蛋白質(zhì)類型其它修飾像乙酰化、甲基化、脂基化也有報道,但并不多見.Ong等采用免疫沉淀方法,同時結(jié)合細胞培養(yǎng)過程中的穩(wěn)定同位素標記氨基酸(stableisotopelabelingbyaminoacidincellculture,SILAC)對甲基化修飾進行定量,鑒定得到了59個甲基化位點.Iwabata等采用二維電泳與免疫印跡結(jié)合的方法對鼠腦、骨骼肌的賴氨酸甲基化、賴氨酸乙?；M行分析,發(fā)現(xiàn)不同器官的賴氨酸甲基化、乙酰化的蛋白質(zhì)類型有很大差別.MacCoss等采用鳥槍法與多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)(multidimensional