第三章 核酸分子的分離提取與酶處理

第三章

核酸分子的分離提取與酶處理本章內(nèi)容第一節(jié)核酸的分離純化第二節(jié)DNA分子的酶切第三節(jié)DNA分子的鏈接第四節(jié)DNA分子的修飾第一節(jié)核酸的分離純化核酸的分離純化是獲得目的基因及載體DNA片段的基本途徑，核酸分離的好壞直接決定了核酸樣品的質(zhì)量。一、核酸分離提取的原則與要求核酸分離純化總的原則是要保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性，防止降解，同時(shí)要排除其他分子的污染。對(duì)于核酸的純化應(yīng)達(dá)到以下三點(diǎn)要求：①核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過(guò)高濃度的金屬離子；②其他生物大分子，如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降低到最低程度；③排除其他核酸分子的污染，如提取DNA分子時(shí)，應(yīng)去除RNA分子，反之亦然。二、核酸提取的主要步驟1.樣品準(zhǔn)備新鮮的動(dòng)植物組織材料，經(jīng)清洗去掉非組織材料雜質(zhì)。植物：液氮凍結(jié)，然后快速碾磨成粉末狀；動(dòng)物細(xì)胞：胰酶消化，再離心沉淀，收集細(xì)胞；微生物：離心沉淀收集菌體。二、核酸提取的主要步驟2.細(xì)胞破碎細(xì)胞的破碎有各種方法，包括物理方法、化學(xué)方法、酶法等。常見(jiàn)的物理方法有超聲波法、均漿法、液氮破碎法、Al2O3粉研磨法等。缺點(diǎn)：容易導(dǎo)致DNA鏈的斷裂。化學(xué)方法和酶法，如采用去污劑十二烷基硫酸鈉(SDs)和溶菌酶或蛋白酶K，在Tris-HCl(pH8.0)的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液中，溫和裂解。DNA中RNA和RNA中DNA的去除。二、核酸提取的主要步驟3.分離純化核酸核酸的純化最關(guān)鍵步驟是去除蛋白質(zhì)，要將核酸與緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分開(kāi)，而且還要避免核酸的降解。二、核酸提取的主要步驟3.分離純化核酸核酸的純化最關(guān)鍵步驟是去除蛋白質(zhì)，要將核酸與緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分開(kāi)，而且還要避免核酸的降解。二、核酸提取的主要步驟4.核酸的沉淀濃縮常用的是乙醇沉淀法。加入1/10體積的乙酸鈉(3mol/LpH=5.2)于DNA溶液中充分混勻；加入2.5倍體積預(yù)冷的乙醇，混合后，置于20℃中15~30min；12000rpm離心10分鐘，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；加入離心管容量的75%乙醇，12000rpm離心2分鐘，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；室溫下，漿開(kāi)蓋的EP管的置于實(shí)驗(yàn)桌上5min，使殘留的液體揮發(fā)至干；加適量的ddH2O溶解DNA沉淀。三、質(zhì)粒DNA的分離純化1.堿裂解法堿裂解法是小量制備DNA較好的方法。原理：利用質(zhì)粒DNA分子較小，且為超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，它與分子較大的染色體DNA有很大差異。利用這種差異可以將它們分離，即在堿性pH(12~12.5)下，DNA分子均變性；恢復(fù)中性時(shí)，線性染色體DNA由于兩條鏈分開(kāi)且基因組分子量大，單鏈互相無(wú)規(guī)則纏繞，不能準(zhǔn)確復(fù)性，就與其他成分共沉淀；而質(zhì)粒DNA分子小且兩條閉合環(huán)狀分子即使變性也較緊密地纏繞在一起，準(zhǔn)確復(fù)性而留于上清溶液中。三、質(zhì)粒DNA的分離純化1.堿裂解法堿裂解法是小量制備DNA較好的方法。原理：三、質(zhì)粒DNA的分離純化2.煮沸法沸法是利用加熱處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在冷卻是即恢復(fù)期天然構(gòu)象，變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在于液相中，通過(guò)高速離（12000g）心將兩者分開(kāi)。然后可用5%CTAB選擇性沉淀DNA。三、質(zhì)粒DNA的分離純化3.CsCl-EB密度梯度平衡離心CsCl是一種大分子量的重金屬鹽，長(zhǎng)時(shí)間超速離心時(shí)，在管中形成1.0000-1.8052g/cm3自上而下增加的密度梯度。含有細(xì)胞裂解液的體系在長(zhǎng)時(shí)間超速離心平衡后，DNA的沉降速度與擴(kuò)散速度達(dá)到平衡，染色體DNA、質(zhì)粒、RNA以及蛋白質(zhì)等不同浮力密度的物質(zhì)可在管內(nèi)不同位置形成區(qū)帶。RNA可與Cs+結(jié)合，密度最大，沉積管底，蛋白質(zhì)漂浮于液面上。三、質(zhì)粒DNA的分離純化3.CsCl-EB密度梯度平衡離心用含氯化銫和溴化乙錠的懸浮密度梯度離心法分離質(zhì)粒和染色體DNA的方法，取決于與線狀DNA和閉環(huán)DNA結(jié)合的溴化乙錠的量的差異。3.CsCl-EB密度梯度平衡離心（CsCldensity-gradientcentrifugation）三、質(zhì)粒DNA的分離純化根據(jù)質(zhì)粒大小和結(jié)構(gòu)與基因組DNA的區(qū)別，還可以采用陰離子交換色譜或分子篩色譜，還可以選用一些商業(yè)化的柱子，凝膠電泳也是一種分子不同分子量DNA的手段。三、質(zhì)粒DNA的分離純化4.DNA的純化對(duì)于一些DNA純化要求高的實(shí)如哺乳類動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物操作等，需要進(jìn)一步提高質(zhì)粒DNA的純度?？刹扇∫韵路椒ǎ孩貱sCl梯度平衡超速離心法；②離子交換或凝膠過(guò)濾柱色譜法；③分級(jí)聚乙二醇沉淀法；④瓊脂糖凝膠電泳片段分離法。四、基因組DNA的制備基因組DNA分子量大，受熱易變性，復(fù)性困難，受剪切力作用易斷裂，因此要采用較溫和的條件和方法?？刹扇∫韵路椒ǎ孩賁DS法；②十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法；③其他，試劑盒。四、基因組DNA的制備五、RNA的提取RNA是目前發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)生物功能最豐富多樣的生物大分子，同時(shí)也是DNA與蛋質(zhì)信息傳遞的橋梁，因此完整RNA的提取和純化是功能基因組時(shí)代的重要手段。如Northern雜交、mRNA分離、cDNA的合成及體外翻譯都是以高質(zhì)量RNA為基礎(chǔ)。原核生物的rRNA分三類:5SrRNA、16SrRNA和23SrRNA。真核生物的rRNA分四類:5SrRNA、5.8SrRNA、18SrRNA和28SrRNA。真核生物的28SrRNA、18SrRNA和5SrRNA。土壤宏轉(zhuǎn)錄組RNA的提取五、RNA的提取所有RNA的提取過(guò)程都有五個(gè)關(guān)鍵：①樣品細(xì)胞或組織的有效破碎；②有效地使核蛋白復(fù)合體變性解離，釋放出RNA；③對(duì)RNA酶的有效抑制；④有效地將RNA從DNA和蛋白質(zhì)混合物中分離；⑤對(duì)于多糖含量高的樣品還要采取措施有效去除多糖雜質(zhì)。但其中最關(guān)鍵的是抑制RNA酶的活性。六、核酸的定量核酸定性定量分析是指導(dǎo)核酸分離純化的重要手段。常見(jiàn)的方法有紫外分光光度法及熒光分光光度法。六、核酸的定量1.紫外分光光度法核酸的最大吸收波長(zhǎng)是260nm,10D值的光密度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50

g/mL，單鏈DNA或RNA為40

g/mL，單鏈寡核苷酸為20

g/mL。通過(guò)測(cè)定在260nm和280m處的紫外吸收值的比值(OD260/OD280)來(lái)估計(jì)核酸的純度。DNA的比值為1.8，若DNA樣品的比值高于1.8，說(shuō)明其中的RNA尚未除盡，比值小于1.8則說(shuō)明殘留酚或蛋白質(zhì)。六、核酸的定量1.紫外分光光度法RNA的比值為2.0。當(dāng)比值為1.8~2.0時(shí)，我們認(rèn)為RNA中蛋白或者時(shí)其他有機(jī)物的污染是可以容忍的。當(dāng)R<1.8時(shí)，溶液中蛋白或者其他有機(jī)物的污染比較明顯，當(dāng)R>2.2時(shí)，說(shuō)明RNA已經(jīng)水解成單核酸了。六、核酸的定量2.熒光分光光度法DNA、RNA本身并不產(chǎn)生熒光，但在熒光染料溴乙錠(EB)嵌入堿基平面之間后，DNA樣品在紫外線照射激發(fā)下，可以發(fā)出紅色熒光，其熒光強(qiáng)度與核酸含量成正比。六、核酸的定量2.熒光分光光度法DNA、RNA本身并不產(chǎn)生熒光，但在熒光染料溴乙錠(EB)嵌入堿基平面之間后，DNA樣品在紫外線照射激發(fā)下，可以發(fā)出紅色熒光，其熒光強(qiáng)度與核酸含量成正比。溴化乙錠（EB）SYBRGreenIGoldViewGelRed七、核酸的凝膠電泳電泳是利用帶電荷物質(zhì)在電場(chǎng)中遷移速率的不同將其分離的方法，而凝膠電泳利用了支持介質(zhì)形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使不同大小的大分子物質(zhì)得以分離并保留于凝膠中，在不同位置形成條帶。電泳遷移率的大小與物質(zhì)的帶電量與分子量的比值(荷質(zhì)比)相關(guān)在中性pH值或堿性緩沖液中，核酸分子骨架上的磷酸基團(tuán)在水中的解離帶有負(fù)電荷，在電場(chǎng)中由負(fù)極向正極遷移。七、核酸的凝膠電泳1.瓊脂糖凝膠電泳不同濃度的瓊脂糖凝膠電泳可分辨不同大小范圍的DNA片段，對(duì)于雙鏈DNA來(lái)說(shuō)，DNA片段在500~60,000bp用瓊脂糖凝膠分離。GeneRuler?100bpDNALadderPlus脈沖場(chǎng)電泳(PulsedFieldGelElectrophoresis,PFGE)施加至少有兩個(gè)電場(chǎng)方向，時(shí)間與電流大小也交替改變，使得DNA分子能夠不斷地調(diào)整泳動(dòng)方向，以適應(yīng)凝膠中不規(guī)則的孔隙變化，達(dá)到分離大分子線性DNA的目的，最大分辨率為5000kb大小的線性DNA分子。七、核酸的凝膠電泳2.聚丙烯酰胺凝膠電泳可用于DNA、蛋白質(zhì)等的分離。核酸片段小于1000bp用聚丙烯酰胺凝膠，含高濃度尿素（7M）的變性聚丙烯酰胺凝膠用于分離短的(<500bp)單鏈DNA或RNA。七、核酸的凝膠電泳3.凝膠電泳分離后核酸片段的回收及純化需將得到的含有目的基因的DNA片段以及提純的質(zhì)粒閉環(huán)DNA，再用合適的限制性內(nèi)切酶分別把它們切開(kāi)，用凝膠電泳把酶切后的不同片段分開(kāi)，從凝膠中回收所需的目的基因片段和載體DNA的線性片段，并加以必需的純化，特別是去除瓊脂糖，排除其對(duì)DNA連接酶的抑制。七、核酸的凝膠電泳3.凝膠電泳分離后核酸片段的回收及純化從瓊脂糖凝膠中回收人們需要的DNA片段的方法有很多：電泳洗脫法、DEAE纖維素膜插片法、低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳挖塊法、凍融法、玻璃奶法、QIAEX法。第二節(jié)DNA分子的酶切3用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞2用于基因克隆的載體1用于核酸操作的工具酶基因工程的必要條件核酸酶是一類能夠水解相鄰兩個(gè)核苷酸殘基間的磷酸二酯鍵，使核酸分子斷裂的一類酶。核酸酶底物核糖核酸酶(RNase)，特異性水解斷裂RNA鏈，如RnaseH脫氧核糖核酸酶(DNase)，專門水解斷裂DNA鏈，如DNaseI核酸酶位置底物核糖核酸酶(RNase)，特異性水解斷裂RNA鏈，如RnaseH脫氧核糖核酸酶(DNase)，專門水解斷裂DNA鏈，如DNaseI核酸外切酶(exonuclease)，從核酸分子的末端開(kāi)始，逐個(gè)消化降解多核苷酸鏈核酸內(nèi)切酶(endonuclease)，從核酸分子的內(nèi)部切割3′,5-磷酸二酯鍵，使核酸鏈斷裂成更小的片段常用的工具酶：序號(hào)工具酶作用方式1限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA2DNA連接酶生成3′-5′磷酸二酯鍵3DNA聚合酶復(fù)制DNA4反轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成5堿性磷酸酶切除末端磷酸基6多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探針標(biāo)記7DNaseI水解斷裂DNA8RNaseH水解斷裂RNA一、限制性核酸內(nèi)切酶（Restrictionendonuclease）限制性核酸內(nèi)切酶是一類識(shí)別雙鏈DNA內(nèi)部特定核苷酸序列的DNA水解酶。它們以內(nèi)切的方式水解DNA，產(chǎn)生5’-P和3’-OH末端。一、限制性核酸內(nèi)切酶（Restrictionendonuclease）1、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)瑞士人Arber的團(tuán)隊(duì)采用放射性同位素標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，在噬菌體入侵宿主細(xì)胞時(shí)，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的噬菌體DNA被降解掉，而宿主自身的DNA未被降解。因此，他們提出了限制-修飾(R-M)假說(shuō)，認(rèn)為細(xì)菌等一些原核生物體內(nèi)存在一種可保護(hù)自身免于外來(lái)DNA(如噬菌體)侵入的防衛(wèi)系統(tǒng)。限制修飾系統(tǒng)(restrictionmodificationsystem)該系統(tǒng)包括限制和修飾兩個(gè)方面的作用。限制(restriction)是指細(xì)菌的限制性核酸酶對(duì)入侵DNA的降解作用，這就限制了外源DNA侵入所造成的危害。修飾(modification)是指細(xì)菌的修飾酶對(duì)于自身DNA堿基分子的甲基化等化學(xué)修飾作用，經(jīng)修飾酶修飾后的DNA分子可免遭細(xì)菌限制酶的降解作用。寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象由兩種酶活性配合完成的：1、修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶，2、核酸內(nèi)切限制酶。寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象由兩種酶活性配合完成的：1、修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶，2、核酸內(nèi)切限制酶。寄主控制的限制與修飾的作用：1、保護(hù)自身的DNA不受限制；2、破壞外源DNA使之迅速降解。根據(jù)限制-修飾現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)的核酸內(nèi)切限制酶，現(xiàn)在已成為重組DNA技術(shù)的重要工具酶。限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及其在分子遺傳學(xué)中的應(yīng)用1965年，Arber提出了生物體內(nèi)存在具有切割基因功能的限制性內(nèi)切酶。1968年成功分離出I型限制性內(nèi)切酶，但這種酶的切割基因功能不理想。1970年，美國(guó)分子生物學(xué)家、遺傳學(xué)家H.O.Smith分離出了II型限制性內(nèi)切酶。1971年，美國(guó)微生物遺傳學(xué)家D.Nathans使用II型限制性內(nèi)切酶首次完成了對(duì)基因的切割。他們的研究成果為人類在分子水平上實(shí)現(xiàn)人工基因重組提供了有效的技術(shù)手段。一、限制性核酸內(nèi)切酶（Restrictionendonuclease）2、限制性核酸內(nèi)切酶的類型和命名限制性核酸內(nèi)切酶的命名規(guī)則屬名種名

株名HindI，HindII，

HindIIIHaemophilus

influenzae

d

嗜血流感桿菌d株（3）同一菌株中所含的多個(gè)不同的限制性核酸內(nèi)切酶：EcoRⅠ(E：屬名；co：種名；R：株；Ⅰ：發(fā)現(xiàn)次序)（1）HindIII（2）EcoRⅠ一、限制性核酸內(nèi)切酶（Restrictionendonuclease）2、II型限制性核酸內(nèi)切酶的作用方式（1）識(shí)別并切割特異脫氧核苷酸序列II型限制性內(nèi)切酶一般能夠識(shí)別4-8個(gè)脫氧核苷酸的序列。一、限制性核酸內(nèi)切酶（Restrictionendonuclease）2、II型限制性核酸內(nèi)切酶的作用方式（1）識(shí)別并切割特異脫氧核苷酸序列（2）識(shí)別序列都是回文結(jié)構(gòu)5’…GCT

GAATTC

GAG…3’3’…CGA

CTTAAG

CTC…5’EcoRI的識(shí)別序列EcoRI的切割位點(diǎn)一、限制性核酸內(nèi)切酶（Restrictionendonuclease）2、II型限制性核酸內(nèi)切酶的作用方式（1）識(shí)別并切割特異脫氧核苷酸序列（2）識(shí)別序列都是回文結(jié)構(gòu)5’…GCT

GAATTC

GAG…3’3’…CGA

CTTAAG

CTC…5’EcoRI的識(shí)別序列一、限制性核酸內(nèi)切酶（Restrictionendonuclease）2、II型限制性核酸內(nèi)切酶的作用方式（1）識(shí)別并切割特異脫氧核苷酸序列（2）識(shí)別序列都是回文結(jié)構(gòu)（3）切割后形成各種黏性末端或平末端粘性末端與平頭末端互補(bǔ)性粘性末端之間堿基配對(duì)促使連接反應(yīng)容易進(jìn)行。平端之間連接反應(yīng)效率很低，提高DNA連接酶和DNA片段濃度等措施可以使反應(yīng)效率增強(qiáng)。粘性末端與平頭末端特點(diǎn)由于其核酸內(nèi)切酶活性和甲基化作用活性是分開(kāi)的，而且核酸內(nèi)切作用又具有序列特異性，故在II型限制性內(nèi)切酶是基因工程中主要的限制酶。二、限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA的方法

II

型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的操作大部分II型核酸內(nèi)切酶需要相似的反應(yīng)條件：Tris-HCl50mMpH7.510mMNaCl0-150mMDTT1mM0-50mM低鹽酶100mM中鹽酶150mM高鹽酶Volume20-100mlTT37℃1-1.5hr1U核酸內(nèi)切酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)1小時(shí)，完全水解1mg標(biāo)準(zhǔn)DNA所需的酶量MgCl2II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的操作II型核酸內(nèi)切酶的雙酶解：位置影響對(duì)鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時(shí)酶切，但應(yīng)注意：5‘GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’BamHISmaI5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’共用位點(diǎn)相互干擾II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的操作II型核酸內(nèi)切酶的雙酶解：對(duì)鹽濃度要求不同的酶，可采取下列方法：使用較貴的酶的鹽濃度，加大便宜酶的用量，同時(shí)酶解低鹽酶先切，然后補(bǔ)加鹽，高鹽酶再切一種酶先切，然后更換緩沖液，另一種酶再切II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的操作酶切回收：0.1倍體積的5MNaAcpH5.42.5倍體積的冰冷乙醇冰浴5分鐘、高速冷凍離心10分鐘、干燥三、影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素1.DNA樣品的純度：蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等（1）加大酶的用量，1mgDNA用10U酶（2）加大反應(yīng)總體積（3）延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間2.DNA樣品的甲基化程度：大腸桿菌中的Dam甲基化酶在5’GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影響

。

大腸桿菌中的Dcm甲基化酶在5’CCAGG3’或5’CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響的酶有EcoRII等A：B：3.核酸內(nèi)切酶的緩沖液性質(zhì)：緩沖液成分：氯化鎂、氯化鈉或氯化鉀、Tris-HCL、β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）以及牛血清白蛋白（BSA）等。高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端pH值等，會(huì)使一些核酸內(nèi)切酶的識(shí)別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的Staractivity現(xiàn)象。3.核酸內(nèi)切酶的緩沖液性質(zhì)：如：EcoRI在正常條件下識(shí)別并切割5’-GAATTC-3’序列，但在pH7.5變?yōu)?.5，甘油濃度超過(guò)5%（v/v），或用Mn2+代替Mg2+時(shí)，EcoRI識(shí)別序列變?yōu)?/p>

5’-AATT-3’。

這使得該酶在DNA分子上的切割位點(diǎn)數(shù)量增加，產(chǎn)物片段變短。大多數(shù)核酸內(nèi)切限制酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度都是37℃，但也有許多例外的情況，例如SmaⅠ是25℃、MaeⅠ是45℃。消化反應(yīng)的溫度低于或高于最適溫度，都會(huì)影響核酸內(nèi)切限制酶的活性，甚至最終導(dǎo)致完全失活。4.酶切消化反應(yīng)的溫度DNA分子的不同構(gòu)型對(duì)核酸內(nèi)切限制酶的活性有很大的影響。某些核酸內(nèi)切限制酶切割超盤旋的質(zhì)粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化線性DNA的高出許多倍，最高的可達(dá)20倍。還有一些核酸內(nèi)切限制酶，切割它們自己的處于不同部位的限制位點(diǎn)，其效率亦有明顯的差別。5.DNA的分子結(jié)構(gòu)用UniversalBuffer和BasalBuffer進(jìn)行限制酶活性表示甲基化對(duì)限制酶活性的影響DoubleDigestion（雙酶切反應(yīng)）和UniversalBuffer（通用緩沖液）的使用表用DNAman對(duì)DNA序列進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析單/雙酶切舉例二、實(shí)驗(yàn)程序：假若一種酶在環(huán)狀質(zhì)粒DNA中只有一個(gè)酶切位點(diǎn),且酶切徹底，紫外燈下檢測(cè)電泳結(jié)果,則單酶切應(yīng)為一條帶,而雙酶切則為兩條帶。如果條帶數(shù)目多于理論值,那么有可能是酶切不完全。如果酶切結(jié)果與酶切前的質(zhì)粒條帶一樣（超螺旋、線性和開(kāi)環(huán)三條帶），則說(shuō)明質(zhì)粒完全沒(méi)有被切開(kāi)三、結(jié)果與分析：M：DL2000marker1:重組質(zhì)粒

第三節(jié)DNA分子的連接3用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞2用于基因克隆的載體1用于核酸操作的工具酶基因工程的必要條件DNA連接酶催化單鏈或雙鏈DNA分子的連接修復(fù)，其作用位點(diǎn)位于DNA分子內(nèi)或分子間相鄰核苷酸的3′-羥基和5′-磷酸間形成共價(jià)的磷酸二酯鍵，使原先斷裂的DNA連接起來(lái)。連接酶(ligase)是一類能將兩個(gè)核酸片段連接起來(lái)的酶。一、連接酶根據(jù)連接酶來(lái)源：1.E.

coliDNA連接酶，大腸桿菌；2.T4DNA連接酶，T4噬菌體；3.熱穩(wěn)定DNA連接酶和T4RNA連接酶，T4噬菌體。連接酶種類DNA連接酶(DNAligase)借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA中相鄰的3′-OH和5′-P之間形成磷酸二酯鍵，在基因工程中用來(lái)將不同來(lái)源DNA鏈進(jìn)行連接，形成重組DNA。在基因工程中常用到的DNA連接酶主要是E.

coli

DNA連接酶和T4DNA連接酶。一、連接酶T4DNA連接酶可催化DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA和雙鏈DNA黏性末端或平末端之間的連接反應(yīng)。連接酶催化DNA連接的最佳反應(yīng)溫度是37℃。T4DNA連接酶T4DNA連接酶與大腸桿菌連接酶相比在基因工程中的應(yīng)用更方便一些，主要用于：①修復(fù)雙鏈DNA上的單鏈缺口(與大腸桿菌DNA連接酶相同)，這是兩種DNA連接酶都具有的基本活性；②連接RNA-DNA雜交雙鏈上的DNA鏈缺口或RNA鏈缺口，前者反應(yīng)速度較快；③連接兩個(gè)平末端雙鏈DNA分子。T4DNA連接酶二、DNA片段之間的連接DNA片段之間的連接可分為四類方法：第一類是黏性末端DNA片段的連接，用DNA連接酶連接具有互補(bǔ)黏性末端的DNA片段；黏性末端二、DNA片段之間的連接DNA片段之間的連接可分為四類方法：第一類是黏性末端DNA片段的連接，用DNA連接酶連接具有互補(bǔ)黏性末端的DNA片段；第二類是平末端DNA片段的直接連接，用T4DNA連接酶直接將平末端的DNA片段連接起來(lái)；二、DNA片段之間的連接DNA片段之間的連接可分為四類方法：第一類是黏性末端DNA片段的連接，用DNA連接酶連接具有互補(bǔ)黏性末端的DNA片段；第二類是平末端DNA片段的直接連接，用T4DNA連接酶直接將平末端的DNA片段連接起來(lái)；第三類是多聚脫氧核苷酸接尾連接，用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶給平末端DNA片段加上多聚脫氧核苷酸尾后，再用DNA連接酶將它們連接起來(lái)；二、DNA片段之間的連接DNA片段之間的連接可分為四類方法：第一類是黏性末端DNA片段的連接，用DNA連接酶連接具有互補(bǔ)黏性末端的DNA片段；第二類是平末端DNA片段的直接連接，用T4DNA連接酶直接將平末端的DNA片段連接起來(lái)；第三類是多聚脫氧核苷酸接尾連接，用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶給平末端DNA片段加上多聚脫氧核苷酸尾后，再用DNA連接酶將它們連接起來(lái)；第四類是接頭連接，在平端DNA片段末端加上化學(xué)合成的接頭(

linker)而形成黏性末端，再用DNA連接酶將各黏性末端DNA片段連接起來(lái)。三、平末端DNA片段的連接1.平末端DNA片段的直接連接，用T4DNA連接酶直接將平末端的DNA片段連接起來(lái)；2.同聚物加尾法，利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移核苷酸的特殊功能，可以在DNA分子3’-OH端連續(xù)添加一系列的核苷酸，如polyA或polyT；3.接頭連接，在平端DNA片段末端加上化學(xué)合成的接頭(

linker)而形成黏性末端，再用DNA連接酶將各黏性末端DNA片段連接起來(lái)。四、影響連接反應(yīng)的因素很多因素都會(huì)影響到連接反應(yīng)的效率，主要包括：（1）溫度，T4DNA連接酶最適溫度是37℃，室溫25℃，16℃或4℃過(guò)夜；（2）DNA末端的性質(zhì)，平末端，粘性末端；（3）DNA片段的大小和濃度，DNA片段的摩爾比為1:3

~1:10；四、影響連接反應(yīng)的因素很多因素都會(huì)影響到連接反應(yīng)的效率，主要包括：（1）溫度，T4DNA連接酶最適溫度是37℃，室溫25℃，16℃或4℃過(guò)夜；（2）DNA末端的性質(zhì)，平末端，粘性末端；（3）DNA片段的大小和濃度，DNA片段的摩爾比為1:3

~1:10；（4）離子濃度，Mg2+、ATP等，Ligasebuffer。DNA連接酶2.DNA連接酶的反應(yīng)條件Tris-HCl50-100mMpH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20mlLT4-15℃4-16hr1UDNA連接酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下15℃反應(yīng)1小時(shí)，完全連接1mgl-DNA（HindIII片段）所需的酶量第四節(jié)DNA分子的修飾第四節(jié)DNA分子的修飾DNA修飾酶類有：1、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase，TdT），又稱末端轉(zhuǎn)移酶2、堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）3、T4