植物病原線蟲的分離方法及形態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)

植物病原線蟲的分離一、 目的要求了解從土壤和植物組織中分離線蟲的基本原理，掌握從土壤和植物組織中分離線蟲的常用方法。學(xué)習(xí)在解剖鏡或擴(kuò)大鏡下用銀子、竹針、毛針、毛筆等工具從水中和濾紙上挑取線蟲的方法。二、 基本原理植物寄生線蟲主要存在于土壤和植物組織中，分離線蟲的方法有許多，要根據(jù)線蟲的種類、研究目的等來選擇適宜的方法。植物寄生線蟲的個(gè)體很小，除極少數(shù)可從植物組織中直接挑出以外，絕大多數(shù)需借助特定的工具和方法才能完成。線蟲的分離主要是利用它的趨水性、大小、比重以及與其他雜質(zhì)的差異，采用過篩、離心、漂浮等措施，將線蟲從植物組織、土壤中分離出來。三、 材料、試劑與儀器1．實(shí)驗(yàn)材料感染根結(jié)線蟲病的植物病根、病土、感染大豆孢囊線蟲或其它孢囊線蟲的病土、感染甘薯莖線蟲的病薯塊等。2．儀器或?qū)嶒?yàn)用具解剖鏡、漏斗分離裝置、漂浮分離裝置、淺盤分離裝置、紗布或銅紗、記數(shù)皿或平皿、小燒杯、小玻管、旋蓋玻璃瓶、40目和325目網(wǎng)篩、線蟲濾紙、餐巾紙、挑針、竹針、毛針、毛筆等。3．試劑線蟲固定液四、實(shí)驗(yàn)操作1．直接觀察分離對(duì)于個(gè)體較大的線蟲如根結(jié)線蟲、孢囊線蟲、粒線蟲的雌蟲等，可直接用挑針從植物組織中挑取，也可在解剖鏡或擴(kuò)大鏡觀察下直接挑取，對(duì)于蟲體稍小的線蟲如莖線蟲、粒線蟲的雄蟲和幼蟲等，需在解剖鏡下，用竹針或毛針直接挑取。取感染根結(jié)線蟲的植物病根材料（若是干材料需用水浸泡過夜），剝開皮層，觀察里面是否有針頭大小、乳白色發(fā)亮的顆粒狀物。用挑針挑取，置凹玻片上水滴中，在解剖鏡或顯微鏡下觀察是否為根結(jié)線蟲雌蟲。2．漏斗分離法該方法操作簡(jiǎn)單，是目前從植物材料中分離線蟲較好的方法。其裝置是將直徑10~15cm的玻璃漏斗架在鐵架上，下面接一段約10cm的橡皮管，橡皮管上裝一個(gè)彈簧夾。（1）將植物材料切碎用雙層紗布包好，浸在盛滿清水的漏斗中，或在漏斗內(nèi)襯放一個(gè)用細(xì)銅紗制成的漏斗狀網(wǎng)篩，將植物材料直接放在網(wǎng)篩中，分離土壤線蟲時(shí)需在網(wǎng)篩上放一層紗布或多孔疏松的紙，上面加一層土樣。（2）加水，靜止24h。提示由于趨水性和自身的重量，線蟲就離開植物組織或土壤，沉降到漏斗底部的橡皮管中。（3）打開彈簧夾，慢慢放出底部約5ml水樣于平皿內(nèi)。（4）在解剖鏡下觀察分離到的線蟲。若線蟲數(shù)量太少，可將水樣倒入離心管中，在1500rpm離心機(jī)中離心3min，倒掉上層清水，將下層沉淀物懸浮后倒入平皿或記數(shù)皿中，在解剖鏡下觀察記數(shù)，然后將線蟲用毛針或毛筆挑入盛有固定液的小玻璃管中備用。提示該方法也可用于分離土壤中的線蟲，尤其是分離較為活躍的線蟲。3．培育分離法對(duì)于用漏斗分離法不易分離到的線蟲，如根結(jié)線蟲和孢囊線蟲的雄性成蟲等，可采用培育分離法。將病根采回后洗去表面土粒，放在培養(yǎng)皿中濕潤(rùn)的濾紙上培育3d,用少量清水沖洗組織和皿底，檢查水中線蟲?；?qū)⒔M織放在有螺旋蓋的玻瓶中，加入幾毫升清水，蓋不要旋緊，在室溫(20~25°C)下培育3d，然后加50ml清水，蓋緊蓋子并輕輕振蕩，后倒出懸浮液使其順序通過40目和325目網(wǎng)篩，用小水流輕輕沖洗325目網(wǎng)篩背面，收集到記數(shù)皿或燒杯中，直接檢查或離心后檢查。提示從土壤中得到病根后要馬上沖洗和培育，因?yàn)?4h后，有50%的線蟲會(huì)從根里爬出，沖洗時(shí)便被沖掉了。4．淺盤分離法該方法原理與漏斗分離法一樣，但分離效果更好，而且泥沙等雜物較少。用兩個(gè)不銹鋼淺盤套放在一起，上面一個(gè)是篩盤，它的底部是篩網(wǎng)，網(wǎng)目大小為10目/英寸，下面一個(gè)是稍大的盛水盤。也可在培養(yǎng)皿上放置一個(gè)稍小的做成淺盤狀的金屬網(wǎng)，網(wǎng)與培養(yǎng)皿底部保持一定距離。分離時(shí)將線蟲濾紙放在網(wǎng)上用水淋濕，上面再放一層餐巾紙，將要分離的土樣或植物材料放在餐巾紙上，在兩盤之間縫隙中加水，淹沒土樣或植物材料，在室溫（20~25C）下保持3d,去掉篩網(wǎng)后，將下面淺盤中的水樣過篩（上層為25目，下層為400目）,將下層篩上的線蟲用小水流沖洗到記數(shù)皿中,觀察記數(shù)。5．漂浮器分離法對(duì)于沒有活動(dòng)能力的孢囊線蟲的孢囊可采用漂浮器分離法（Fenwick-Oostenbrink改良漂浮法）,該法需要特制的分離裝置。分離時(shí)先將漂浮筒內(nèi)盛滿清水,將100g風(fēng)干的土樣放在上篩中,用強(qiáng)水流沖洗土樣,使其全部洗到漂浮筒內(nèi),并從環(huán)頸水槽流到承接的細(xì)篩（100目）中,再用細(xì)水流沖洗一會(huì),使漂浮物全部流入細(xì)篩。將細(xì)篩中的孢囊等漂浮物用水洗入燒杯或三角瓶中,再倒入鋪有濾紙的漏斗中,用毛筆收集并觀察濾紙上的孢囊。提示漂浮分離的土樣必須要風(fēng)干，否則抱囊不能在水中漂浮，需用比重小于 1的溶劑。五、所需時(shí)間流程|[x] +漏斗分離樣品浸泡——放出水浸液、離心 鏡檢兇培育分離樣品培育 過篩、收集、鏡檢面]I淺盤分離樣品浸泡□樣過篩、收入記數(shù)皿、鏡檢4?漂浮分離10min左右。六、實(shí)驗(yàn)作業(yè)比較各種線蟲分離方法的優(yōu)缺點(diǎn)。一、目的和要求識(shí)別主要植物線蟲病的癥狀和病原線蟲的形態(tài)特征。包括雌雄同型及異型線蟲.二、材料和用具草莓芽干尖線蟲(Aphelenchoidesbesseyi)或珠藍(lán)線蟲；小麥粒線蟲(Anguinatritici)，破壞性莖線蟲(Ditylenchusdestructor)，寄主甘薯，南方根結(jié)線蟲(Meleidogynearenaria)，寄主花生等；大豆胞囊線蟲(Heteroderaglycines)；長(zhǎng)針線蟲(Longidorussp.);毛刺線蟲(Trichodorussp.)。寄生性線蟲病的危害狀標(biāo)本或幻燈片。線蟲的固定液有多種，常用的有FA、FAA和TAF等三種：(1)FA液：福爾馬林(36％甲醛)10ml，蒸餾水90ml;FAA液：福爾馬林10ml，冰醋酸1ml,蒸餾水89ml，TAF液：三羥基乙胺2mi，福爾馬林7m1，蒸餾水91ml。三、內(nèi)容與方法1線蟲形態(tài)的觀察(1)粒線蟲屬(Anguina)觀察由小麥粒線蟲危害小麥引起的癥狀，注意小麥?zhǔn)芎Σ课唬芎Φ那o葉有無扭曲或畸形蟲癭的外形與麥粒有什么區(qū)別取蟲癭一個(gè)，用刀片切開或挑針挑破，挑取蟲癭內(nèi)部的白色棉絮狀物于載玻片上的水滴中蓋上蓋玻片，置于低倍鏡下鏡檢，可見到成蟲、卵和幼蟲。雌蟲、雄蟲均為線形，雌蟲體形較雄蟲粗大，往往卷曲，體內(nèi)的卵巢頂端彎曲。雄蟲昆部有交合刺，交合傘幾乎包到尾尖。(2)莖線蟲屬(Ditylenchus)觀察甘薯莖線蟲(D．destructor)危害甘薯的癥狀，剖開病薯可見到條點(diǎn)狀褐色或白粉干腐癥狀，挑取少量組織于載玻片的水滴中，加蓋玻片鏡檢，可見到卵、幼蟲、成蟲等各個(gè)蟲態(tài)。甘薯莖線蟲雌雄同型，都是線形，雌蟲稍粗大，尾端尖細(xì)。注意口針、食道球形態(tài)，腸和卵巢平行，單卵巢，卵單行排列。雄蟲較細(xì)小，尾部可見交合刺、交合傘，交合傘后端距蟲體末端有一定間隔。因蟲體很小，觀察內(nèi)部器官需用高倍鏡。觀察示范鏡下的雄蟲尾部形態(tài)。(3)滑刃線蟲屬(Aphelenchoides)有各種危害狀，例如水稻(Rice干尖線蟲(A.besseyi)引起水稻(Rice)干尖線蟲病，以劍葉的干尖最明顯，劍葉尖端 2－6厘米一段變?yōu)榘咨?。干枯卷縮，幼穗形成時(shí)線蟲侵入穎殼內(nèi)，引起秕粒或不很充實(shí)；菊葉線蟲（）為害菊的葉片，使葉片組織壞死。鏡檢水稻（Rice）干尖線蟲或珠藍(lán)線蟲，觀察口針、食道球的形態(tài)特征、雄蟲尾部的交合刺，有無交合傘（4）胞囊線蟲屬（Heterodera）觀察大豆胞囊線蟲（H.glycines）的危害癥狀。挑取病根上的雌蟲，肉眼可見到線蟲頭部已鉆入寄主組織，蟲體外露，多為檸檬形，黃褐色。制片鏡檢，大豆胞囊線蟲的卵大多不排出體外，整個(gè)雌蟲體后期變成顏色深褐的卵囊，特稱為胞囊（少數(shù)可排部分卵于體尾的膠質(zhì)囊內(nèi)）。（5）根結(jié)線蟲屬（Meloidogyne）觀察蔬菜根結(jié)線蟲（M.spp.）或花生、茄科植物根結(jié)線蟲危害癥狀，鏡檢觀察雌蟲蟲體形態(tài)。根結(jié)線蟲屬分種的主要依據(jù)是：會(huì)陰花紋的形態(tài)特征，胞囊線蟲分種是根據(jù)陰門椎周圍的形態(tài)特征加以區(qū)別的。（6）外寄生線蟲這類線蟲只有取食時(shí)才將口針穿刺到寄主植物的體內(nèi)，蟲體外露，平時(shí)生活于土壤中。由于取食與棲息不在一處，它們經(jīng)常往返于土壤與植物根系之間，而且取食的植株不固定，一條線蟲可以危害多株植物。在它們轉(zhuǎn)移危害時(shí)，線蟲往往成為其它病害的傳播介體，例如煙草環(huán)斑病毒(TRSV就是通過線蟲傳播的。劍線蟲屬(Xiphinema)：齒針很長(zhǎng)，基部球大為瘤狀，導(dǎo)環(huán)位置低。長(zhǎng)針線蟲屬(Longidorus):齒針很長(zhǎng)，基部球不大，導(dǎo)環(huán)位置高。毛刺線蟲屬(Trichodorus):瘤針彎曲，

基部漸粗，形似毛刺L■佃百存琶州ct基部漸粗，形似毛刺L■佃百存琶州ctrl■暫BS二粧在示范鏡下觀察比較外寄生線蟲頭部及口針部的形態(tài)特征。2線蟲的殺死、固定和線蟲死活的鑒別線蟲活體的形態(tài)特征是線蟲工作者初步區(qū)分線蟲種類的一個(gè)重要指標(biāo)，但是要進(jìn)一步區(qū)分和鑒別它們，必須經(jīng)過殺死、固定以后才能作仔細(xì)的分辨，有的還要經(jīng)過局部加工處理，使特征部位顯示出來才能確定。因此，殺死并很好地固定線蟲十分重要，否則就不能將線蟲標(biāo)本很好地保存下來。2．1線蟲的殺死少量線蟲的殺死是用毛針或竹針將線蟲挑放在有水滴的載玻片上，水滴部分在酒精燈火焰上來回移動(dòng)3-4次，使水滴溫度升高，當(dāng)彎曲的線蟲突然伸直時(shí)立即停止加熱，此時(shí)蟲體已被殺。大量線蟲的殺死是將線蟲放在表面皿或小玻皿中，加入等量的沸水；也可將盛有線蟲液的玻管直接浸入60-65水浴中浸2－3分鐘，不斷振搖使加熱均勻，當(dāng)線蟲僵直時(shí)停止加熱。2．2線蟲的固定與保存殺死后的線蟲用毛針移放到FAA或TAF固定液中，操作要在解剖鏡下完成。福爾馬林液可使蟲體硬化，不腐??；乙酸則使角質(zhì)膜膨脹，但乙醇可使表皮皺縮變形。標(biāo)本在FAA液中不宜保存太久，在TAF液中則可長(zhǎng)期保存。線蟲在固定過程中要逐步更換固定液，通常是每隔3－4小時(shí)即吸去表層液，約1／2的容積，并加進(jìn)新的固定液，連續(xù)換液3-4次后即可長(zhǎng)期保存。2．3線蟲死活的鑒別方法從土壤或種苗材料中分離得到的線蟲，有時(shí)都不活動(dòng)，對(duì)于它們是否存活需作鑒定，這在藥劑處理試驗(yàn)中最為重要。（1）高錳酸鉀染色法：在凹玻片上加一滴0．5-1%的KMnO4液，然后挑放數(shù)條線蟲在溶液中，經(jīng)1—2分鐘后在顯微鏡下觀察，死線蟲已染成棕紅色，活蟲不易染色。（2）鹽水實(shí)驗(yàn)：試蘊(yùn)：將線蟲挑放到凹玻片上的2-5%NaC1液中，經(jīng)3-5分鐘后在顯微鏡下觀察，死蟲無反應(yīng)，活蟲則卷曲或活動(dòng)劇烈。四、作業(yè)與思考題繪小麥粒線蟲雌蟲、雄蟲體形圖，注意交合刺、交合傘。繪滑刃線蟲雄蟲尾部圖，注意有無交合傘（1）植物寄生線蟲的致病特點(diǎn)是什么（2）根結(jié)線蟲和胞囊線蟲為害根部時(shí)，癥狀有何不同（3）哪一種方法鑒別線蟲死活簡(jiǎn)便植物病原線蟲及其所致病害癥狀觀察一、目的線蟲是一種低等無脊椎動(dòng)物，在自然界中分布廣泛、種類繁多、形態(tài)各異；寄生在植物上的線蟲，從某些種類和造成的經(jīng)濟(jì)損失上看，僅次于真菌、細(xì)菌和病毒，而且常與其它病原物一起造成復(fù)合侵染。植物受線蟲危害后表現(xiàn)的癥狀與一般的病害癥狀相似，因此稱為線蟲病。近年來，線蟲病害發(fā)生日趨嚴(yán)重，所以線蟲的研究愈來愈受到人們的重視。本實(shí)驗(yàn)的目的是熟悉植物病原線蟲的基本形態(tài)及其所致病害的癥狀特點(diǎn)，以及學(xué)習(xí)分離和鑒定主要植物病原線蟲的方法。、內(nèi)容、材料和方法、內(nèi)容、材料和方法(一)植物線蟲病害癥狀類型觀察植物受線蟲為害后，除和真菌、細(xì)菌、病毒等病原物引起的相似癥狀，也有其特有癥狀與之相區(qū)別，線蟲多在地下活動(dòng)，根部受害比較多見，根部受害的癥狀，有的根生長(zhǎng)點(diǎn)受破壞而停止生長(zhǎng)或卷曲，有的根上形成瘤腫或過度分枝而形成發(fā)根或須根團(tuán)；植物根部受害后，地上部生長(zhǎng)受到影響而表現(xiàn)植株矮縮，色澤失常和早衰，嚴(yán)重時(shí)整株枯死；植株地上部的癥狀，有頂芽和花芽壞死，莖葉卷曲或組織壞死，形成葉癭或種癭等。植物病原線蟲不同屬所致癥狀也有一定的區(qū)別，根結(jié)線蟲屬 (Meloidogyne)和胞囊線蟲屬(異皮線蟲屬Heterodera)所致病害地上部一般無特異癥狀，僅表現(xiàn)生長(zhǎng)不良、植株萎黃，地下部須根明顯增多，往往形成須根團(tuán)；根結(jié)線蟲刺激根部腫脹形成根結(jié)， 而胞囊線蟲則不形成根結(jié)， 但可直接看見附著根側(cè)的雌蟲體；粒線蟲屬(Anguina)為害地上部分，使莖葉扭曲，穗部變形，籽粒變?yōu)橄x癭；莖線蟲屬 (Ditylenchus)主要為害地下部分，使塊根、塊莖、鱗莖呈干腐狀或濕腐狀，地上只略見莖葉呈波狀卷曲、發(fā)育遲緩等；而滑刃線蟲屬(Aphelenchoides)為害葉片和芽而引起局部干枯壞死等。觀察下列線蟲標(biāo)本，注意癥狀特點(diǎn)：小麥粒線蟲病(Anguinatritici)；甘薯莖線蟲病(Ditylenchusdipsaci)；水稻干尖線蟲病(Aphelenchoidesbesseyi)；花生根結(jié)線蟲病(Meloidogyneincognita)；大豆胞囊線蟲病(Heteroderaglycines)；甘薯根結(jié)線蟲病(二)分類及主要屬形態(tài)觀察關(guān)于線蟲分類地位，以前放在線形動(dòng)物門(Nematelminthes)的線蟲綱(Nematoda)中，但多數(shù)學(xué)者主張單設(shè)線蟲門(Nemata)，這種觀點(diǎn)已被接納。根據(jù)線蟲尾部側(cè)面感覺孔一一側(cè)尾腺口的有無，線蟲綱分為側(cè)尾腺口綱(Secernentea)和無側(cè)尾腺口綱(Adenophorea)兩個(gè)綱，植物寄生線蟲絕大多數(shù)在側(cè)尾腺口綱中，其中主要是墊刃目(Tylenchida)的線蟲對(duì)植物有致病性，特別是該目中墊刃總科(Tylenchoidea)和滑刃總科(Aphelenchoidea)中的一些線蟲，以下學(xué)習(xí)五個(gè)重要屬。H2US-J■J1粒線蟲屬(Anguina)(?？艫nguinidae)H2US-J■J1切取浸泡的小麥粒線蟲病蟲癭制片鏡檢，注意觀察蟲體形態(tài)，雌成蟲蟲體呈肥胖卷曲狀。頸部縊縮,肛門孔退化，雄成蟲蟲體細(xì)長(zhǎng)，略彎，交合傘包至尾尖。22植物病原線蟲包括那些重要類群 這些類群是怎樣劃分的莖線蟲屬（Ditylenchus）（?？艫nguinidae）挑取甘薯莖線蟲病病組織制片鏡檢雌雄蟲體形態(tài)，注意雌蟲陰門位置，雄蟲交合傘不包至尾尖，交合刺基部變寬，并有突起等特點(diǎn)刺基部變寬，并有突起等特點(diǎn)胞囊線蟲屬（Heterodera）（異皮科Heteroderidae）取漂浮器分離到大豆胞囊線蟲的胞囊在解剖鏡下觀察形狀，顏色，區(qū)分頭尾部，然后在低倍顯微鏡下壓破胞囊（或取制備片）鏡檢卵或二齡幼蟲的形態(tài)。根結(jié)線蟲屬（Meloidogyne）（異皮科Heteroderidae）鏡檢花生根結(jié)線蟲制備片，注意雌雄成蟲的形態(tài)和胞囊線蟲屬有何不同蟲卵產(chǎn)于何處rf?-IIIT■；VTflIHkliltilf?1hrf?-IIIT■；VTflIHkliltilf?1h 止刁審事祈■W>?4 4-4*44:■絶■ft■