實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥wonca研究

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥wonca研究

重癥無力（mg）是b細(xì)胞誘導(dǎo)和依賴t細(xì)胞的自身免疫性疾病之一。cd4-t細(xì)胞亞型之間的平衡變化決定了該病的結(jié)局，在疾病機(jī)制中起著非常重要的作用。以往對MG發(fā)病機(jī)制的研究認(rèn)為,Th1和Th2細(xì)胞之間功能失衡致使疾病發(fā)生,但隨著Th17/Treg等新亞型的發(fā)現(xiàn),又有了新的解釋。本研究采用MG的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型觀察實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力(Experimentalautoimmunemyastheniagravis,EAMG)發(fā)病過程中,Th1/Th2/Th17/Treg細(xì)胞之間的相互關(guān)系,以期闡述EAMG發(fā)病過程中B細(xì)胞抗體分泌機(jī)制。1.材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料SPF級純系健康雌性Lewis大鼠,6~8周齡,體重160~180g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。大鼠自由食水,晝夜12h交替光照,室溫條件下飼養(yǎng)。1.2國際專利劑和標(biāo)準(zhǔn)R-AChRα97-116肽段購自西安聯(lián)美生物科技有限公司;結(jié)核菌素購自美國DifcoLaboratories公司;ELISA試劑盒購自上海森雄(中國)公司;不完全弗氏佐劑(IFA)購自美國Sigma公司;BFA和PE-antiratFoxp3購自美國eBioscience公司;PMA和Inomycin為美國ALEXISBiochemicals公司產(chǎn)品;FITC-antiratCD4、PE-antiratIFNγ和PE-antiratIL-4購自美國BD公司;Rabbitanti-ratIL-17購自美國SantaCruzBiotechnology公司;PE-Cy3anti-rabbitIgG購自美國Caltag公司。1.3各組大鼠的免疫將Lewis大鼠隨機(jī)分為完全弗氏佐劑(CFA)早、晚期發(fā)病時(shí)對照相和EAMG早期(初次免疫后13d)、高峰期(初次免疫后50d)發(fā)病時(shí)相4組,每組8只。經(jīng)乙醚麻醉后,EAMG組每只大鼠以含50μgR-AChRα97-116肽段、1mg結(jié)核菌素和100μlIFA的200μlPBS經(jīng)尾根部皮下免疫,于免疫后第30天,以含50μgR-AChRα97-116和100μlIFA的200μlPBS經(jīng)尾根部皮下追加免疫;CFA組大鼠免疫方法同EAMG組,其中以PBS取代R-AChRα97-116。初次免疫后,依據(jù)臨床評分標(biāo)準(zhǔn),每兩天進(jìn)行體重測量和臨床體征評定。1.4研磨預(yù)處理無菌條件下剪開大鼠腹部、腿部皮膚,取出腫大的腹股溝、腘窩、腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié),去除表面脂肪和被膜,置于研磨網(wǎng)上,用5ml注射器內(nèi)芯做圓周運(yùn)動(dòng)在研磨網(wǎng)上研磨,直至纖維組織留下。再用5ml注射器(帶針頭)來回吹打液體幾次,將大的組織團(tuán)塊分散開,制成單細(xì)胞懸液,收集至離心管內(nèi),4℃,2500r/min離心10min后棄上清,沉淀經(jīng)漩渦振蕩器振蕩,使其變得疏松,用10mlHBSS洗滌細(xì)胞1次,4℃,2500r/min離心10min,EAMG淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,200μm目尼龍網(wǎng)過濾,收集單細(xì)胞懸液,臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞活性(應(yīng)大于90%)。1.5細(xì)胞誘導(dǎo)染色于發(fā)病早期和高峰期分離CFA和EAMG組大鼠淋巴細(xì)胞,在R-AChRα97-116肽段刺激下體外培養(yǎng)3d,FACS法檢測CD4+T細(xì)胞亞型的差異。染色前,在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入BFA(1∶1000稀釋)、PMA(20ng/ml)和Inomycin(1μg/ml),孵育4h;用FITC-antiratCD4進(jìn)行CD4染色;固定破膜后,分別加入PE-antiratIFNγ、PE-antiratIL-4、PE-antiratFoxp3和Rabbit-antiratIL-17一抗,及PE-Cy3anti-rabbitIgG二抗,上流式細(xì)胞儀檢測。1.6elisa測定細(xì)胞培養(yǎng)中il-4、tgf-及il-6含量將CFA和EAMG組發(fā)病早期和高峰期的淋巴細(xì)胞(2×106個(gè)/ml)分別在R-AChR的刺激下體外培養(yǎng)3d,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,用ELISA試劑盒檢測IFNγ、IL-4、IL-17、TGF-β及IL-6的含量,操作按試劑盒說明進(jìn)行。1.7統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS13.0軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)用ue0af±s表示,組間比較采用t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.結(jié)果2.1treg細(xì)胞比例變化經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測,兩組Th1(CD4+IFNγ+)、Th2(CD4+IL-4+)、Th17(CD4+IL-17+)和Treg(CD4+Foxp3+)細(xì)胞的比例變化及分布見圖1。與CFA組相比,EAMG組Th1、Th2和Th17細(xì)胞的百分比下降,Treg細(xì)胞的百分比升高,但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為1.953、0.263、2.220和1.302,P值分別為0.987、0.813、0.068和0.240),見表1。2.2il-6含量的比較檢測結(jié)果顯示,EAMG組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFNγ和IL-4的含量明顯低于CFA組(t值分別為5.225和11.631,P值分別為0.0020和0.0001);IL-6的含量明顯高于CFA組(t=26.465,P=0.0001);IL-17和TGF-β的含量與CFA組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為2.302和1.762,P值分別為0.0609和0.1281)。見表2。2.3細(xì)胞、trad和treg細(xì)胞比例對比的影響經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測,兩組Th1、Th2、Th17和Treg細(xì)胞的比例變化及分布見圖2。與CFA組相比,EAMG組Th1和Th17細(xì)胞的百分比明顯升高(t值分別為2.578和15.214,P值分別為0.0275和0.0001);Th2和Treg細(xì)胞的百分比明顯下降(t值分別為5.357和5.366,P值分別為0.0003和0.0003)。見表3。表明在EAMG發(fā)生過程中,輔助性T細(xì)胞亞型之間的平衡失調(diào),表現(xiàn)為致炎性細(xì)胞(Th1、Th17)比例上調(diào),抑炎性細(xì)胞(Th2、Treg)比例下降。2.4il-4和tgf-含量檢測結(jié)果顯示,EAMG組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFNγ和IL-17含量明顯高于CFA組(t值分別為3.253和3.451,P值分別為0.0172和0.0136);IL-4和TGF-β含量明顯低于CFA組(t值分別為9.059和8.337,P值分別為0.0001和0.0002);IL-6含量與CFA組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.372,P=0.7226)。見表4。3.cd4+t細(xì)胞亞型在eage中的作用在大鼠EAMG模型的發(fā)病過程中,會(huì)有兩個(gè)階出現(xiàn)臨床期癥狀,第1時(shí)相出現(xiàn)在初次免疫后的第13天左右,表現(xiàn)為食欲減退、活動(dòng)減少及輕微的無力癥狀,但持續(xù)4d左右即可自動(dòng)恢復(fù)。Lewis大鼠EAMG發(fā)病的早期癥狀是由巨噬細(xì)胞在突觸后膜的聚集所引發(fā)的,而浸潤的巨噬細(xì)胞的凋亡是癥狀緩解的主要因素。第2時(shí)相(即疾病的高峰期)出現(xiàn)在初次免疫后的第50天左右,這時(shí)大鼠由食欲減退、活動(dòng)減少,逐漸發(fā)展為全身靜止?fàn)顟B(tài)下的肌無力,隨著時(shí)間的延長而加重,最終導(dǎo)致死亡。與前一階段不同的是,這個(gè)階段的臨床癥狀是由于機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生了針對自身抗AChR的抗體,是自身免疫性疾病發(fā)生的根本原因。眾所周知,B細(xì)胞是產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞,而研究表明,AChR特異性輔助性CD4+T細(xì)胞亞型通過其分泌的細(xì)胞因子及協(xié)同刺激信號(hào)的激活,可誘導(dǎo)B細(xì)胞特異性抗體的分泌,在MG/EAMG的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用。以往CD4+輔助性T細(xì)胞亞型按其分泌的細(xì)胞因子或表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的不同分為Th1細(xì)胞(CD4+IFNγ+)、Th2細(xì)胞(CD4+IL-4+)和Treg細(xì)胞(CD4+Foxp3+),它們是通過分泌特異性細(xì)胞因子起到免疫調(diào)節(jié)作用。Th1細(xì)胞的主要效應(yīng)因子IFNγ被證實(shí)在器官特異性自身免疫性疾病的起始和發(fā)展階段都是必不可少的。在EAMG中,將IFNγ轉(zhuǎn)基因定位于神經(jīng)-肌肉接頭處或體外給予IFNγ,均可加重臨床癥狀,而IFNγ基因敲除鼠對EAMG的發(fā)生具有耐受性。然而,對Th2細(xì)胞及IL-4在EAMG中作用的研究卻出現(xiàn)了爭議,Balasa等指出,IL-4在EAMG中是非必需的;但Milani等卻提出,IL-4能夠阻止EAMG的發(fā)生,對慢性自身免疫性疾病有促進(jìn)好轉(zhuǎn)的作用。Treg細(xì)胞是另外一類獨(dú)立鑒定的CD4+T細(xì)胞亞型,被證實(shí)與自身免疫性疾病的耐受有關(guān)。給予肌無力大鼠體外富集的Treg細(xì)胞可以抑制EAMG的發(fā)病進(jìn)程,體液免疫中AChR的特異性反應(yīng)降低,同時(shí)脾組織中表達(dá)Foxp3的CD4+CD25+細(xì)胞的數(shù)量顯著上調(diào)。其他研究小組證實(shí),Treg細(xì)胞的主要效應(yīng)因子TGF-β與EAMG的免疫耐受密切相關(guān)。另外一種新的輔助性CD4+T細(xì)胞亞型Th17及其主要效應(yīng)因子IL-17已被證實(shí)具有促炎性作用,并且在自身免疫性疾病的發(fā)病過程中起到了非常重要的作用,在EAMG的發(fā)生和發(fā)展過程中已經(jīng)證實(shí),Th17細(xì)胞參與了EAMG的發(fā)生,并發(fā)揮了免疫調(diào)節(jié)的作用。本研究顯示,在疾病發(fā)生的早期階段,Th1、Th2、Th17細(xì)胞比例下降,而Treg細(xì)胞比例上升;細(xì)胞因子IFNγ和IL-4含量下降,而IL-17、TGF-β和IL-6含量升高,說明初始化CD4+T細(xì)胞在TGF-β和IL-6的刺激下已發(fā)生向Th17細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,同時(shí)抑制了向Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,且這4種輔助性CD4+T細(xì)胞的亞型網(wǎng)絡(luò)格局已