uplc-pda法同時測定香精香料中14種禁限用物質

uplc-pda法同時測定香精香料中14種禁限用物質

2011年，國家衛(wèi)生部、農業(yè)部等部門根據風險監(jiān)測和風險控制研究中遇到的問題，公布了151種食品和飼料中非法添加的物質清單，包括47種可以在食品中添加的非基本食品、22種“輕中規(guī)定食品”和82種“禁止在動物飼料、飲用水和家禽養(yǎng)殖過程中食用的藥物和物質”。目前對于部分禁限用成分已有標準檢測方法;有部分物質的分離分析方法已見報道,包括液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質譜法、離子色譜法等,但針對這些禁限用物質的檢測方法還不全面,部分方法還存在檢測效率較低、耗時長的缺點。苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、安賽蜜、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、檸檬黃、日落黃、誘惑紅、酸性紅是151種非法添加物名單中的“易濫用食品添加劑”,GB2760-2011《食品添加劑使用標準》中對其有嚴格的限量要求;而酸性橙II、堿性嫩黃O則屬于“違法添加的非食用物質”。香精香料為添加劑中一個重要的組成部分,為此本文結合超高效液相色譜(UPLC)分析速度快、分析靈敏度高的優(yōu)點,通過梯度洗脫和可變波長掃描檢測,建立了UPLC同時測定香精香料中的這14種禁限用物質的檢測方法,方法操作簡便、分析快速準確,可以很好地應用于香精香料實際樣品的分析檢測。1實驗部分1.1超聲純化系統(tǒng)ACQUITY超高效液相色譜儀-光電二極管陣列(PDA)檢測器(美國Waters公司);Milli-Q超純水純化系統(tǒng)(美國Millipore公司);AE200分析天平(瑞士METTLER公司);SK5200型超聲波振蕩器(上海科導超聲儀器有限公司);0.22μm有機針式過濾器(上海安譜科學儀器有限公司)。1.2對羥基苯甲酸甲酯methylparaben,etylparaben,fluka安賽蜜(acesulfamepotassium,純度>99.9%)、糖精鈉(saccharinsodium,純度>99.9%),苯甲酸(benzoicacid,純度>99.9%)、山梨酸(sorbicacid,純度>99.9%)、對羥基苯甲酸甲酯(methylparaben,純度>99.9%)、對羥基苯甲酸乙酯(ethylparaben,純度>99.9%)、對羥基苯甲酸丙酯(propylparaben,純度>99.9%)、對羥基苯甲酸丁酯(butylparaben,純度>99.9%)均購自美國SUPELCO公司;日落黃(sunsetyellow,純度>87%)、誘惑紅(alluraredAC,純度>80%)、酸性紅(ponceau4RC,純度>70%)、檸檬黃(tartrazine,純度>99.9%)、酸性橙II(acidorangeII,純度>99.9%)購自美國Fluka公司;堿性嫩黃O(auramineO,純度>99.0%)購自上海安譜科學儀器有限公司。1.3試驗條件1.3.1標準溶液的配制準確稱取(精確到0.1mg)適量固體標準品于10mL容量瓶中,用甲醇(色譜純)定容,分別配成1.0g/L的標準儲備液,儲存于4℃冰箱內,備用;吸取適量的標準儲備液,用水定容分別配制混合標準溶液;如需要,用水繼續(xù)稀釋成所需要的系列混合標準溶液。1.3.2柱溫和流動相色譜柱:ACQUITYUPLCTMBEHC18柱(50mm×2.1mm,1.7μm);流速:0.2mL/min;柱溫:35℃,進樣量:5μL;檢測波長掃描范圍:200～500nm。流動相:A相為10mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%(v/v)乙酸),B相為乙腈(色譜純)。梯度洗脫程序:0.0～3.0min,5%B;3.0～8.0min,5%B～30%B;8.0～12.0min,30%B～70%B;12.0～12.5min,70%B～5%B。1.3.3超聲材料的配制選取國內不同生產企業(yè)在用的10個香精香料樣品作為考察樣品,其中包括4種浸膏類樣品、3種香精類樣品、3種料液類樣品。樣品均質(固態(tài)樣品需均質,液態(tài)樣品可直接溶解):準確稱取1g左右試樣置于10mL容量瓶中,用水定容。如不能溶解,可加入適量的甲醇幫助溶解,室溫下超聲15min分散均質,均質溶液備用;如有固體顆粒,以5000r/min離心5min,取上層清液,備用。樣品萃取:分別準確移取上述均質溶液或上層清液1mL置于10mL容量瓶中,依次加入1mL甲醇、1mL10%氨水水溶液及適量水,超聲萃取15min,最后用水定容至10mL,搖勻,用0.22μm有機濾膜過濾萃取液,待測。2結果與討論2.1色度條件優(yōu)化2.1.1樣品的制備及檢測利用PDA檢測器在200～500nm波長范圍內對各組分的標準溶液進行全掃描,以各組分有最大吸光度的波長為定量波長對待測物質進行檢測。其中檸檬黃的定量波長為426nm,安賽蜜為226nm,糖精鈉為230nm,酸性紅為332nm,日落黃為480nm,苯甲酸為225nm,誘惑紅為314nm,山梨酸為259nm,酸性橙II為230nm,堿性嫩黃O為436nm,對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯均為255nm。紫外檢測器為通用型檢測器,色譜分離前段的檢測物質較容易受到基質的影響。檸檬黃由于定量波長為426nm,具有專屬性,本身可以排除很多低波段雜質的干擾;而糖精鈉雖然處于230nm較容易受基質干擾的波長下,但由于其保留時間已經在2min左右,受到基質影響不大;安賽蜜由于比較靠近系統(tǒng)出峰時間,較易受到基質干擾,但通過全波段掃描后提取特定定量波長的過程,本身就具有排除干擾的功能,另外由于UPLC色譜柱分離柱效較高,分離度較好,基質和安賽蜜能得到較好的分離,同時還可以通過加標等輔助手段以確保定量的準確性。2.1.2流動相背景的影響液相色譜法的流動相中常用的有機相有甲醇和乙腈。由于甲醇本身的毒性低于乙腈,因此首先考慮使用甲醇。但以不同的淋洗梯度進行分離,強極性的幾種小分子物質(如安賽蜜、糖精鈉、苯甲酸等)均會同時出峰,且峰形不夠尖銳,分離度不佳;另外根據PDA檢測器掃描發(fā)現,糖精鈉、酸性紅等的最大吸收波長靠近200nm,而甲醇的紫外吸收波長(190nm)也在這個區(qū)域,由于流動相背景的增加和干擾,對目標物質的出峰和檢測靈敏度會造成一定的影響。而以乙腈作為流動相的有機相時這種影響相對較小。因此本實驗選擇乙腈作為流動相的有機相。2.1.3乙酸緩沖液ph值對反應的影響對于所檢測的禁限用物質,文獻報道較為常用的是乙酸銨緩沖溶液作為流動相。乙酸銨緩沖溶液中酸的添加與否對于目標物質的分離有重要的影響,且乙酸的添加對于苯甲酸以及山梨酸的出峰峰形有很好的促進作用,實驗發(fā)現如果不添加乙酸調節(jié)乙酸銨緩沖液的pH值,安賽蜜、糖精鈉以及苯甲酸等物質全部都集中在2min以內出峰。為了考察酸的添加量對于目標物質分離的影響,考察了在流動相中添加體積分數為0.05%、0.1%、0.2%的乙酸后的分離效果,比較了乙酸添加量對于分離度和峰形的影響,發(fā)現添加0.1%乙酸時,各組分的分離和峰形最佳(見圖1)。2.1.4流速對分析結果的影響分別考察了流速0.1、0.2、0.3mL/min對分離分析的影響,結果見圖2?？梢园l(fā)現:流速越高,目標物質的出峰時間越快,峰形也越尖銳;在0.3mL/min的流速下,苯甲酸提前出峰,與酸性紅同時出峰,影響分離。而流速越慢,則出峰時間明顯拖后,峰展寬明顯,分析時間加長,在0.1mL/min的流速下,整個分析時間大于13.0min,不利于快速分析的開展。在各組分同時提前或者延后的情況下,保留較弱的極性物質受到流速的影響尤為明顯;當流速為0.2mL/min時,各個目標組分能較好地分離,且分析時間較短,因此選擇最佳流速為0.2mL/min。2.1.5柱溫對苯甲酸分離度的影響柱溫對于高效液相色譜分析來說十分重要,既可以影響出峰時間,也會影響峰形?？疾炝?0、35、40℃柱溫對于目標物質的分離情況,結果發(fā)現,溫度升高,各組分出峰時間均有不同程度的提前,且對出峰較早的幾種物質影響更為明顯;當柱溫為30℃時,苯甲酸出峰稍遲,導致與誘惑紅的分離度變小;而柱溫為40℃時,苯甲酸出峰變快,與日落黃的分離度變小。綜合考慮各個目標組分的分離度和出峰情況,最終選擇柱溫為35℃。2.2樣品預處理方法的優(yōu)化2.2.1萃取效率的提高針對目標物的前處理方法的報道有很多,采用的方法有直接溶液萃取法,也有固相萃取法。本實驗測定的目標物大部分可以直接溶于水,因此直接用水進行萃取是一個較為簡便和低成本的方法。但是如果直接用水萃取,對羥基苯甲酸酯類防腐劑的回收率并不理想,對羥基苯甲酸丁酯的回收率更是在50%以下,因此實驗中考慮添加有機相(甲醇、乙腈)來提高該類物質的回收率,甲醇由于其低毒和廉價成為首選。本實驗分別考察了添加體積分數為5%、10%、20%、30%、50%的甲醇對于目標物萃取效率的影響。結果發(fā)現,隨著甲醇添加量的提高,對羥基苯甲酸類檢測物質的回收率稍微有提高,但甲醇添加量若超過10%,對羥基苯甲酸丁酯的回收率又有明顯的下降;甲醇添加量對于苯甲酸、山梨酸等沒有明顯的影響;但是安賽蜜和糖精鈉的回收率在添加了超過10%甲醇后受到較大的干擾,在添加20%及以上甲醇的實驗中,發(fā)現兩個物質基本不出峰,回收率有明顯的下降,這有可能是由于添加了有機溶劑后,有更多的基質被萃取,1min以前的雜質峰明顯變大變雜,從而影響目標物的出峰和分離,而且安賽蜜和糖精鈉是水溶性甜味劑,有機溶劑的添加不利于萃取的進行。綜合考慮,最終選擇10%甲醇為最佳有機溶劑添加量。2.2.2氨的含量對提取效率的影響實驗發(fā)現,如果單獨采用甲醇和水對目標物進行萃取,色素類目標物的回收率都不是很理想,甚至有不出峰的現象;這可能是由于所檢測的色素類物質多為苯磺酸鹽類化合物,其在沒有一定電離度的條件下不能得到很好的萃取,因此本實驗考慮向萃取溶液中添加一定量的氨水溶液,以促進色素類物質的電離,達到提高萃取效率的目的。實驗中考察了添加體積分數為0.5%、1%、2%、3%的氨水對提取效率的影響,發(fā)現隨著氨水含量的增加,色素類物質的響應有明顯的提高,而安賽蜜和糖精鈉的回收率則沒有明顯的變化,但如果氨水含量過高,則會由于影響苯甲酸的電離而造成苯甲酸不出峰或者與誘惑紅同時出峰的結果。綜合考慮各個檢測組分的提取效果,最后選擇添加1%氨水對樣品進行萃取。2.3線性范圍與比對在優(yōu)化的色譜條件下對所配制的系列濃度的混合標準溶液進行測定,得到的色譜圖見圖3。以目標物的色譜峰面積y對其質量濃度x(mg/L)進行線性回歸。從表1中可以看出,14種目標物在各自的線性范圍內線性關系良好,相關系數基本大于0.999(除了堿性嫩黃O為0.9950,對羥基苯甲酸丁酯為0.9961外)。在不含目標物的空白樣品中添加標準樣品,按照1.3.3節(jié)方法對樣品進行處理后再進行測定,調整適合的濃度,以所檢測物質的信號強度為基線噪聲信號強度的3倍時的含量為該檢測物質的檢出限,得到所檢測物質的檢出限為0.32～2.51mg/kg(見表1)。2.4加標回收率和精密度在一典型料液空白樣品中添加質量濃度為5、10和20mg/L的混合標準溶液,每個添加水平平行測定5次,進行加標回收率和精密度的測定,所得到的平均加標回收率和相對標準偏差(RSD)見表2。2.5禁限用物質測定結果選取國內不同生產企業(yè)在用的10個香精香料樣品作為考察樣品,采用本實驗建立的方法進行處理與測定,結果發(fā)現,色素類和甜味劑類禁限用物質均未檢出;有3個樣品檢出苯甲酸,其含量分別為150、160、100mg/kg;檢出山梨酸的