土壤真菌基因組dna提取方法優(yōu)化及其多樣性和代表性分析

土壤真菌基因組dna提取方法優(yōu)化及其多樣性和代表性分析

1土壤微生物全基因組dna提取土壤真菌是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要成員。作為生物地球化學循環(huán)的重要參與者，它在碳、氮、磷、硫等養(yǎng)分循環(huán)中發(fā)揮著重要作用。同時作為土壤生態(tài)系統(tǒng)外源有機污染物的重要分解者之一,在環(huán)境健康等方面發(fā)揮著重要作用。由于真菌組成與結構的復雜性,到目前為止,自然土壤環(huán)境中大部分真菌尚不能人工分離培養(yǎng),自然棲息環(huán)境中150萬種真菌僅有5%～10%已被人類認識(Bassam&Caetano-Anolles,1991;Hawksworth&Rossman,1997;Hawksworth,2001)。要客觀地揭示土壤中真菌群落結構組成、生態(tài)功能以及相互關系,最直接有效的方法是從土壤中提取全部微生物基因組DNA,并利用合適的分子生物學分析技術,對其中真菌組成、變化及功能進行研究(Ranjardetal.,2000;Lordetal.,2002;張漢波等,2003;Agnellietal.,2004;deLipthayetal.,2004;Kirketal.,2004)。因此,從土壤樣品中直接提取的真菌全基因組的質量和代表性將影響到人們對土壤中真菌種群組成、結構與豐度的認識,建立適宜的土壤真菌全基因組DNA提取方法對開展土壤真菌分子生態(tài)學研究至關重要。土壤生態(tài)系統(tǒng)是化學組成最為復雜的系統(tǒng)之一,其中許多復雜組分,尤其是腐殖質酸類物質,不僅影響提取的土壤微生物全基因組DNA質量,同時也對后續(xù)PCR擴增、雜交以及內切酶消化等均將產生負面影響。由于真菌細胞壁結構特殊,含有大量幾丁質以及多糖類物質,使得土壤真菌DNA的提取比細菌難度更大。同時,不同地域土壤的理化性質有著很大差異,許多土壤基因組DNA提取方法能夠為土壤的微生物生態(tài)研究提供良好基礎,但在另外一些土壤中的應用卻受到了限制(Zhouetal.,1996;Krsek&Wellington,1999;Milleretal.,1999;Bürgmannetal.,2001;Martin-Laurentetal.,2001;Roose-Amsalegetal.,2001;Robeetal.,2003;Bertrandetal.,2005)。中國北方土壤腐殖質酸含量較高,DNA提取相對困難,因此,本實驗針對真菌結構特點,在傳統(tǒng)土壤微生物基因組DNA提取(Hurt,2001;Andersonetal.,2003;Brodieetal.,2003;Anderson&Cairney,2004)和純培養(yǎng)真菌DNA提取方法(Cenis,1992;李紹蘭等,2002)的基礎上,結合蝸牛酶、纖維素酶及溶菌酶等細胞裂解的常用酶制劑(尹睿等,2002),優(yōu)化了一種適合于北方土壤真菌全基因組DNA提取的有效方法,為開展北方土壤真菌分子生態(tài)學研究奠定基礎。2材料和方法2.1蘑菇的來源和培養(yǎng)供試菌株見表1。所有供試菌株培養(yǎng)均采用PDA斜面培養(yǎng)基,于25℃培養(yǎng)4～5d。2.2土壤樣品的理化性質分別采集中國科學院沈陽生態(tài)站、中國科學院長白山森林生態(tài)系統(tǒng)定位站和沈陽生態(tài)所烏蘭敖都荒漠化實驗站具有不同理化性質的3種土壤樣品(表2)。土壤樣品以叉花點式采樣法采集,分別取5處表層0～20cm土壤樣品共10kg,充分混勻,過2mm篩后于-65℃保存?zhèn)溆谩?.3土樣的制備供試土壤采自中國科學院海倫農業(yè)生態(tài)實驗站小麥-玉米-大豆輪作地表層0～20cm土層,稱取250g土樣,121℃,30min濕熱滅菌。取等量斜面培養(yǎng)收集到的菌體(表1)于無菌勻漿器中,混勻;加入少許無菌水,勻漿;無菌條件下將勻漿液加入250g滅菌黑土中,充分混勻后于-20℃保存?zhèn)溆谩?.4dna的提取分別收集少許培養(yǎng)皿中PDA培養(yǎng)基上生長的菌絲體于1.5mlEP管中,加入0.95ml提取緩沖液(100mmol·L-1EDTA+100mmol·L-1Tris+1.5mol·L-1NaCl,pH8.0),在旋渦混合器上振蕩混勻,再加入0.05ml20%的SDS使終濃度為1%,65℃水浴30min后,參考Zhou等(1996)的DNA提取方法,提取純菌DNA,溶解于TE(10mmol·L-1Tris+1mmol·L-1EDTA),并于-20℃保存?zhèn)溆谩?.5裂裂裂解應用4種不同處理手段:1)液氮研磨;2)凍融(至-65℃冰箱中30min,-65℃水浴30min)3次;3)2%SDS,65℃裂解;4)纖維素酶、蝸牛酶和溶菌酶(終濃度分別為6、3和1mg·ml-1)37℃裂解(王衛(wèi)衛(wèi)等,2002),將其進行不同組合,提取本實驗中制備的投菌土樣真菌全基因組DNA,并從中選出7種提取效果較好的方法,具體組合見表3。經SDS裂解之后,土壤微生物裂解液采用Yeates等(1998)的方法進行DNA抽提,提取到的DNA溶液于-20℃保存?zhèn)溆谩?.6土壤真菌dna的提取對于采集的3種自然土壤樣品均采用表3的方法5(凍融3次+酶解180min+SDS裂解60min)進行土壤真菌全基因組DNA提取,所提取DNA溶液于-20℃保存?zhèn)溆谩?.7凝膠電泳dage用真菌通用引物U1/U2-GC(Sandhuetal.,1995)對純菌DNA以及土壤總DNA進行PCR擴增,目的產物為真菌28SrDNA上從403～662bp的一段260bp序列。擴增條件為:94℃預變性3min;94℃變性1min,50℃退火40s,72℃延伸1min,35個循環(huán);最后72℃延伸10min。變性梯度凝膠電泳(DGGE)采用D-Codesystem(Bio-RadLaboratoriesInc,Hercules,CA,USA),8%聚丙烯酰胺凝膠,變性梯度為30%～70%(100%變性相當于7mol·L-1尿素和40%去離子甲酰胺),PCR產物進樣量為40μl。電泳在60℃,1×TAE(40mmol·L-1Tris,20mmol·L-1冰乙酸,1mmol·L-1Na2-EDTA),200V電壓條件下進行5h(Krsek&Wellington,1999;Ranjardetal.,2000;Sigleretal.,2004)。電泳后,凝膠用SYBRGold染色或用改進的Bassam和Caetano-Anolles(1991)銀染方法,染色膠片干燥后進行掃描分析,封片保存。3結果與分析3.1不同方法所獲得dna的pcr-dage分析利用表3中的7種方法分別對真菌投菌土壤基因組DNA進行提取,其DNA提取液濃度及DNA質量見表4,瓊脂糖凝膠電泳圖譜見圖1。由表4和圖1可見,7種方法提取的DNA濃度各有差異,且質量不同。其中方法4濃度最高,為12.2μg·g-1土,方法3濃度最低,為7.4μg·g-1土。從A260/A280和A260/A230比值分析,方法2所獲得的DNA提取液質量最好,分別為1.74和1.53。從電泳圖譜分析,所有7種方法均可獲得片段大小接近的DNA條帶,且均大于19kb。這些片段明顯大于一般土壤全基因組DNA片段(接近于20kb),可能是因為本試驗中所用投菌土壤為滅菌土壤中僅加入真菌菌絲體,而真菌等真核微生物基因組比細菌等原核微生物基因組大得多。對上述7種方法所獲得的投菌土壤DNA進行真菌特異性引物PCR,其擴增產物DGGE圖譜見圖2。由圖2可知,方法1和方法5所獲得的真菌全基因組DNA樣品經PCR-DGGE后所得到的條帶數量最多,顯示出較好的真菌種群的代表性。其中方法7實際上為Zhou等(1996)所采用的提取土壤中革蘭氏陽性菌基因組DNA的經典方法,由于它在土壤環(huán)境樣品微生物全基因組DNA提取中的有效性而一直被廣泛應用。但是,圖2表明,利用該方法提取土壤真菌時所獲得的DGGE條帶數在所有7種提取方法中最少,表明該方法在分析土壤真菌種群多樣性和代表性方面并不理想。由于方法5比方法1易于操作,因此,本文在進行3種自然土壤真菌全基因組DNA提取與多樣性分析時均采用方法5。3.2pcr-dage圖譜本文采取PCR-DGGE方法分別對所選擇的12種真菌純培養(yǎng)物基因組DNA進行分析。另外,利用方法5對3種不同來源的自然土樣以及投菌土樣進行DNA提取,并利用真菌特異性引物進行PCR-DGGE分析,其結果見圖3。利用真菌通用引物U1/U2-GC分別對12種不同純培養(yǎng)真菌基因組DNAPCR-DGGE結果顯示,除了泳道3(粒狀青霉)、泳道6(繩狀青霉)和泳道10(黃柄曲霉)以及泳道4(小可銀漢霉)和泳道7(卷枝毛霉)之間分別擁有相同條帶類型外,不同真菌均擁有各自特征性條帶,并且大部分真菌擁有2～3個不同拷貝數。投菌土樣的泳道共計有17條帶,涵蓋了所有純培養(yǎng)真菌的特征性條帶類型,證明利用本實驗中的方法5可獲得所有12種被投加到滅菌土壤中的真菌,利用該方法提取的土壤全基因組DNA具有較好的真菌組成代表性。泳道14～16分別為3種不同來源,具有不同理化性質的土壤樣品全基因組DNA-PCR-DGGE圖譜。土壤等環(huán)境樣品DNA的提取除受所采用的提取方法制約外,其本身的理化性質對DNA提取的效率和質量也有很大影響。一般來說,土壤中有機質含量越高,所提DNA的產量越大,質量越差;土壤中粘粒比例越高,則DNA的純度越低(張瑞福等,2003)。在本實驗3種自然土壤樣品中,長白山暗棕壤所提取的DNA顯淡棕色,而其它2種土壤所提取DNA為無色,與文獻報道相一致(Zhouetal.,1996;楊瑞馥,2000;張瑞福等,2003)。從圖3可見,3種自然土樣PCR-DGGE圖譜條帶豐富,說明利用本實驗所建立的土壤真菌全基因組DNA提取方法5進行土壤真菌多樣性研究時,土壤的理化性質對分析其真菌組成影響并不明顯。4土壤真菌dna的提取和多樣性分析土壤真菌DNA提取一直是真菌分子生態(tài)學研究所面臨的難題。一般土壤總DNA提取中所用到的溶菌酶對真菌細胞壁作用極小,而蝸牛酶和纖維素酶常用于真菌原生質體的制備,可以有效地分解真菌細胞壁。本實驗在傳統(tǒng)土壤總DNA提取方法優(yōu)化的基礎上引入蝸牛酶和纖維素酶對真菌細胞壁的分解作用,通過所建立的含有12種不同真菌的混菌土壤樣品模型比較了7種不同的土壤真菌全基因組DNA提取方法,并對其DNA片段大小、產量、質量