烏頭堿對大鼠心律失常模型的影響

烏頭堿對大鼠心律失常模型的影響

現(xiàn)在，對抗心力衰竭藥物模型的篩選和評價存在許多問題：1。體動物模型對藥物反應的影響因素多，藥物反應的動物與人體差異大，甚至存在質差異。2.烏霉堿通常被認為是誘導大鼠心律失常模型，并且大多數(shù)陽性對照藥物的療效不佳。3.大腿骨移植引起的復發(fā)性心律失常模型更多，主要表現(xiàn)為大腿骨移植后的大變化，通道位置難以每個位置，受體速度也會影響心律失常的嚴重程度。實驗動物的性別和體重影響模型的穩(wěn)定性和可靠性。上述因素嚴重影響了抗心律失常藥物的評價和篩選。因此急需穩(wěn)定、可靠、準確的篩選和評價抗心律失常藥物的模型。本文應用酶解法分離單細胞,結合膜片鉗技術,建立單細胞篩選和評價抗心律失常藥物模型。1材料和方法1.1實驗動物無特殊病原微生物大鼠,♀♂各半,體重200～250g(Ⅱ級,No09-2-1),由哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物中心提供。1.2電極液mmoll-1臺氏液含(mmol·L-1):NaCl126,KCl5.4,MgCl21,CaCl21.8,NaH2PO40.33,glucose10,HEPES10,NaOH調pH為7.4;KB(Kraftbrune)保存液含(mmol·L-1):glutamicacid70,taurine15,KCl30,KH2PO410,MgCl20.5,egtazicacid(EGTA)0.5,HEPES10,glucose10,1%albumin,KOH調pH為7.4;電極液(mmol·L-1):KCl20,potassiumasparate110,MgCl21,HEPES5,EGTA10,Na2ATP5,KOH調pH為7.2。膠原酶(Ⅱ型),EGTA,?；撬?小牛血清蛋白(BSA)以及烏頭堿均購自Sigma公司。1.3對心臟組織的分離方法同以前文獻報道將大鼠用2%的戊巴比妥鈉麻醉后開胸,迅速取出心臟,主動脈逆行插管連于Langendorff灌流裝置上,以正常臺氏液約8ml·min-1連續(xù)灌流5min,洗去心臟殘血,然后用無鈣臺氏液灌流約10min,心臟停止搏動后,應用含0.05%Ⅱ型膠原酶的無鈣液灌流分離心臟單細胞,當心臟變軟、色澤變淺時開始取心肌組織,每隔2min取1次。以上操作均在37℃恒溫,并充0.95O2+0.05CO2條件下進行。將不同時間取下的心室肌組織放于裝有KB液的試管中,用吸管輕輕吹打,使之分散成單個細胞,置于4℃冰箱穩(wěn)定1h待用。選擇桿狀、耐鈣、橫紋清晰無顆粒的細胞進行實驗研究。1.4細胞外液的脈沖激光雷達實驗方法應用全細胞膜片鉗技術記錄單細胞離子電流。所用微電極用兩步法拉制而成,制成的微電極充灌電極液后電阻在2～3MΩ之間。將準備好的微電極連于膜片鉗儀(Axopatch200B,AxonUSA)的探頭上。分離好的單細胞置于浴槽中,用正常臺氏液以3ml·min-1恒速灌流沖洗細胞表面,形成高阻封接(>10GΩ)后,用脈沖式抽吸打破細胞膜,形成全細胞構型,用電壓鉗和電流鉗模式進行刺激和記錄。實驗過程由計算機軟件pCLAMP6.04(AxonInstrument)控制,數(shù)-模轉換器完成刺激信號的產生、反饋信號的采集以及數(shù)據分析。電極液和細胞外液之間的液接電位(10～11mV)未補償。信號輸入經過1KHz的濾波,數(shù)據存于計算機硬盤以便分析。實驗在室溫(19～22℃)下進行。2觀測指標2.1動作電位apd形成全細胞構型后,應用電流鉗,在保持電壓0mV條件下,給予一持續(xù)2ms的80mV的脈沖刺激,使心肌細胞產生一次動作電位。2.2mmoll-1的制備大鼠心室肌細胞鈉電流的記錄是在細胞外液中低鈉(5mmol·L-1,其余用等滲氯化膽堿取代)、室溫下進行。保持電壓-80mV,刺激電壓從-70mV開始,以10mV步階階躍至+30mV。2.3cshs的取代在室溫下(19～22℃),將細胞外液中的NaCl用等摩爾的氯化膽堿取代,用CsCl和CsOH分別取代相應的KCl和KOH,即無鈉、無鉀外液,電極液同樣無鈉鉀,從而排除鈉電流、鉀電流的干擾。在鉗制電壓模式下記錄,保持電壓-80mV,刺激電壓從-40mV起以10mV步階給予去極化刺激至+50mV,持續(xù)時間100ms,間隔時間10s。2.4鉀電流大鼠心肌細胞以瞬時外向鉀電流(Ito)為主,同時記錄內向整流鉀電流(Ik1)。2.5統(tǒng)計分析數(shù)據以ˉx±s表示。用配對t檢驗分析給藥前后動作電位時程和離子電流的變化。3結果3.1-mol-1和apd50對大鼠心肌動作電位的影響形成全細胞構型后,在電流鉗模式下記錄正常動作電位,鉗制5min后,給予烏頭堿1μmol·L-1,分別記錄給藥后1、5、10min的動作電位,給藥15min后用正常臺氏液以3ml·min-1沖洗,沖洗15min后記錄動作電位時程。結果表明烏頭堿能夠延長APD,使大鼠心肌細胞復極50%的動作電位時程(APD50)由(103.35±7.71)ms延長至(176.4±16.43)ms,使復極90%的動作電位時程(APD90)由(150.23±7.02)ms延長至(236.03±23.22)ms(P<0.01,n=8),但APD50,APD90沖洗15min后恢復不明顯。應用奎尼丁10μmol·L-1后APD90進一步延長至(316.15±67.39)ms,與烏頭堿組比較有顯著意義。但應用維拉帕米10μmol·L-1后動作電位時程恢復近正常。結果見Tab1及Fig1,2。3.2除極化電壓下mv將分離好的大鼠心室肌單細胞置于1ml灌流槽中,細胞附壁后,以正常臺氏液灌流沖洗,形成全細胞構型后,保持電壓-80mV,以10mV步階階躍至+40mV,持續(xù)時間100ms,分別記錄各除極化電壓下的電流。結果提示灌注烏頭堿1μmol·L-15min后,發(fā)現(xiàn)烏頭堿增加INa,當除極電壓在-50mV時INa從(254±55.3)pA增加至(4530.2±475.1)pA(n=4,P<0.01);當灌注奎尼丁5min后INa電流被抑制,應用奎尼丁10min后抑制率為33.59%,結果見Fig3,4。3.3灌注東北部小鼠心肌組織ica-l本研究中ICa-L記錄過程無衰減(衰減5%則棄之不用),實驗中浴槽液體及電極液無鈉鉀,從而排除鈉、鉀電流的干擾。記錄ICa-L保持電壓-40mV,刺激波寬300ms,步階電壓10mV。大鼠心室肌細胞ICa-L電流峰值在刺激電壓0mV至10mV區(qū)間,當灌注1μmol·L-1烏頭堿5min后,ICa-L增加,除極0mV電位時ICa-L從(727.9±178.0)pA增加至(1082.1±222.2)pA(n=6,P<0.01)。灌注烏頭堿使大鼠心室肌細胞ICa-L增加時,灌注維拉帕米10μmol·L-15min后發(fā)現(xiàn)維拉帕米減少烏頭堿誘發(fā)的ICa-L增加,15min后作用最強,抑制率達120%。此作用不是ICa-L的衰減,因用正常臺氏液沖洗后該電流恢復正常。結果見Fig5,6。3.4鉆頭堿對ik1表達的影響全細胞構型形成后,在電壓鉗模式下記錄Ik1電流。Ik1電流的激活:保持電壓固定于-40mV,在-120～+60mV之間,每隔10mV連續(xù)給予超極化和去極化刺激,脈沖持續(xù)300ms,刺激間隔時間10s。以300ms穩(wěn)態(tài)值作為測定Ik1電流值。預先在細胞外液中加入CdCl2300μmol·L-1以阻斷ICa。結果表明,烏頭堿增加內向整流鉀電流的內向成分,在-120mV的刺激電壓下,Ik1的內向成分從(2007.1±359.3)pA增加至(2317.7±401.8)pA(n=10,P<0.01),在實驗電壓-30mV條件下,烏頭堿減弱Ik1的內向整流趨勢,即電流由正常的(-22.796±9.20)pA增加為外向趨勢(2.98±1.89)pA(n=10,P<0.01)。烏頭堿對大鼠心室肌細胞Ik1的作用如Fig7,8所示。3.5ito的電流幅度細胞外液中應用Cd2+0.3mmol·L-1,Ba2+0.2mmol·L-1分別阻斷ICa和Ik1,從保持電壓-70mV激活至+40mV,步階電壓為10mV,持續(xù)1000ms,以外向電流峰值表示Ito的電流幅度。結果表明烏頭堿具有一定的抑制瞬時外向鉀電流的作用,實驗電壓為+50mV時,Ito外向電流峰值由正常對照的(3391.4±522.3)pA下降到(2956.3±504.9)pA(P<0.01,n=6fromsixrats)。結果如Fig9,10所示。4抗心力衰竭藥物篩選及評價指標4.1結合拉多通道改良型模型一個理想的抗心律失常藥物自身對動作電位時程無縮短作用,但應使烏頭堿延長的動作電位時程縮短或恢復正常,維拉帕米有此作用,可作為此模型的陽性對照藥。4.2鈉電流陽性對照藥可選奎尼丁,應用奎尼丁后鈉電流幅度低于正常值,但奎尼丁過度延長動作電位時程,臨床表現(xiàn)為具有誘發(fā)LQT的潛在危害。4.3鈣Ⅳ類抗心律失常藥物應具有抑制烏頭堿增加L-型鈣電流的作用,陽性對照藥可選維拉帕米。5抗心律失常藥物的篩選模型抗心律失常藥物的研制開發(fā)仍然是當前國內外研究的熱點,但近年來開發(fā)成功應用于臨床的藥物卻微乎其微,且藥物開發(fā)中往往因實驗動物模型的結果和臨床人體對藥物反應差距較大,影響了新藥研制開發(fā)。傳統(tǒng)的抗心律失常藥物實驗動物模型均存在共同的不足,如個體差異大、臨床符合率低等。因此,建立新的抗心律失常藥物篩選模型是新藥開發(fā)的關鍵和基礎。以往研究證明烏頭堿是INa激動劑,是該試劑誘發(fā)心律失常的機制,我們研究證明其對INa有促進作用,但對ICa-L和IK1亦有明顯的增加作用,對Ito呈現(xiàn)抑制作用,明顯延長APD,這些也是烏頭堿誘發(fā)心律失常的主要機制,對烏頭堿誘發(fā)大鼠心律失常模型陽性對照藥以往選奎尼丁,但此研究結果提示陽性對照藥應首選胺碘酮、維拉帕米。近年來時有報道烏頭堿誘發(fā)嚴重的心律失常,應用胺碘酮治療療效甚好。但由于對烏頭堿誘發(fā)心律失常的離子機制仍認為是激動鈉通道,限制了對烏頭堿中毒的成功治療。除少數(shù)幾個抗心律失常藥物外,多數(shù)抗心律失常藥物往往不同程度延長APD,過度延長APD易出現(xiàn)長Q-T間期綜合征,誘發(fā)尖端扭轉型心律失常,一個理想的抗心律失常藥物應適度抑制INa,ICa-L和IK1,對APD適度延長或使APD恢復正常水平。本研究建立的藥物篩選模型,選擇單個心室肌細胞作為研究對象,以電生理指標為觀測指標,同時觀察了目前公認的幾大類陽性藥物對本模型中烏頭堿誘發(fā)的大鼠單個心室肌細胞動作電位時程和離子電流改變的治療作用,結果表明,Ⅰ類抗心律失常藥物奎尼丁具有抑制烏頭堿增加鈉內流的作用,但研究發(fā)現(xiàn),該藥物加重烏頭堿誘發(fā)的動作電位時程延長,這也與臨床上奎尼丁誘發(fā)長Q-