優(yōu)勢(shì)小基因組工業(yè)微生物的構(gòu)建

優(yōu)勢(shì)小基因組工業(yè)微生物的構(gòu)建

傳統(tǒng)的工業(yè)微生物采集是通過(guò)隨機(jī)突變（物理或化學(xué)因素）進(jìn)行的。其操作靶點(diǎn)目標(biāo)不明確、且需要大量的篩選工作,才能得到優(yōu)良的菌株。分子生物技術(shù)的發(fā)展推動(dòng)了基因工程技術(shù)的使用,人們能夠目標(biāo)明確的進(jìn)行菌種改造,如:基因刪除、克隆、整合或重組等,加快了工業(yè)微生物菌種改造的發(fā)展。代謝工程將分子育種和生物過(guò)程系統(tǒng)工程方法相結(jié)合,對(duì)胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)的諸多特征進(jìn)行精確定量的分析,通過(guò)重組DNA技術(shù)來(lái)賦予細(xì)胞理想的特性,使工業(yè)微生物菌種改造又向前推進(jìn)了一大步。隨著基因組測(cè)序技術(shù)的不斷進(jìn)步,基因組工程亦應(yīng)運(yùn)而生?；蚪M工程(genomeengineering)是指為了實(shí)現(xiàn)某一目標(biāo)對(duì)復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行有意地、廣泛地遺傳修飾。本文所介紹的“工業(yè)微生物菌種改造的新方法——優(yōu)勢(shì)小基因組生產(chǎn)菌的構(gòu)建”就是基于基因組的數(shù)據(jù),對(duì)工業(yè)菌種進(jìn)行基因組層面的遺傳改造。1最小基因組和優(yōu)勢(shì)小基因組菌株的構(gòu)建可行性最小基因組是指在最適宜條件下維持細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所必需的最小數(shù)目的基因,優(yōu)勢(shì)小基因組菌株是保留有菌株特殊功能基因簇的最小基因組菌株?；蚪M減少可以改善代謝效率,減少代謝調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的冗余,獲得高效的電轉(zhuǎn)化率,準(zhǔn)確的復(fù)制重組基因和穩(wěn)定的質(zhì)粒復(fù)制,基因組越小生長(zhǎng)速度越快等,可提高菌株的預(yù)測(cè)性和可控性。優(yōu)勢(shì)小基因組菌株可以提高目標(biāo)產(chǎn)物的合成量和含量,盡可能的消除副產(chǎn)物,提高菌株的生長(zhǎng)繁殖速率,降低原料消耗,縮短生產(chǎn)周期。最小基因組和優(yōu)勢(shì)小基因組菌株的構(gòu)建也就是在認(rèn)識(shí)目標(biāo)菌株遺傳信息的基礎(chǔ)之上,根據(jù)具體的研究目的對(duì)于菌株基因組的精簡(jiǎn)。眾所周知,利用基因工程和代謝工程技術(shù)所獲得的工業(yè)微生物菌株,比傳統(tǒng)育種方式能夠獲得更具優(yōu)勢(shì)性狀的菌種,極大地推動(dòng)了微生物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。然而,在發(fā)酵產(chǎn)業(yè)依然廣泛存在有:(1)發(fā)酵過(guò)程有副產(chǎn)物、(2)底物轉(zhuǎn)化率不高(非目的代謝過(guò)程消耗過(guò)多的能量)、(3)生長(zhǎng)周期長(zhǎng)(菌體生長(zhǎng)繁殖速度慢)和(4)菌株不穩(wěn)定(基因組中可轉(zhuǎn)位元件的存在)等亟待解決的問(wèn)題,也是不爭(zhēng)的事實(shí)。優(yōu)勢(shì)小基因組菌株恰恰能夠克服上述缺點(diǎn)。本文所介紹的基因組精簡(jiǎn)的例證,足以證明優(yōu)勢(shì)小基因組菌株構(gòu)建是可行的。有人說(shuō),“微生物基因組是微生物在自然界經(jīng)過(guò)了長(zhǎng)期的進(jìn)化所形成的,它本身就是一個(gè)‘非常精簡(jiǎn)’了的基因組。采用外力干預(yù)基因組的組成,未必就能獲得理想的結(jié)果”!誠(chéng)然,野生菌株在自然界,為了適應(yīng)千變?nèi)f化的自然生存條件,為了抵御同類生物的生存競(jìng)爭(zhēng)以及自然界存在的生物種群之間的基因水平轉(zhuǎn)移等,進(jìn)化形成了現(xiàn)有野生菌的基因組。這是不爭(zhēng)的事實(shí)。但是,人類利用微生物進(jìn)行生產(chǎn)實(shí)踐和科學(xué)研究的條件是已知的,是可控的,與微生物在自然界的生存競(jìng)爭(zhēng)條件相比,是極其不一樣的。因此,野生菌株基因組中的某些片斷是可以刪除的,微生物基因組也是可以精簡(jiǎn)的。這樣經(jīng)過(guò)基因組精簡(jiǎn)所構(gòu)建的優(yōu)勢(shì)小基因組微生物可控性更強(qiáng),可預(yù)測(cè)性也會(huì)更高。一些成功的案例已經(jīng)證明精簡(jiǎn)的小基因組微生物繁殖速度更快。2基因組簡(jiǎn)化方法工業(yè)生產(chǎn)菌株基因組精簡(jiǎn)的過(guò)程概括起來(lái)主要包括:(1)在掌握菌株全基因組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上,(2)確立菌株生長(zhǎng)繁殖發(fā)育的必需基因和生產(chǎn)某產(chǎn)品的功能基因及其關(guān)聯(lián)基因,(3)建立無(wú)痕敲除大片段基因序列的方法,采用所構(gòu)建的方法進(jìn)行基因組精簡(jiǎn),(4)檢驗(yàn)所構(gòu)建的優(yōu)勢(shì)小基因組菌株的生長(zhǎng)和生產(chǎn)狀況。2.1納入研究的生物DNA測(cè)序技術(shù)自發(fā)明以來(lái)在推動(dòng)分子生物學(xué)發(fā)展方面一直起著至關(guān)重要的作用。1995年生殖道支原體(Mycoplasmagenitalium)全基因組測(cè)序完成后,越來(lái)越多的生物被納入基因組測(cè)序完成的名單。截至到2011年7月1日,GOLD(GenomesOnLineDatabase)公開報(bào)道:已完成6891株綜合微生物全基因組(IntegratedMicrobialGenomes)的測(cè)序,包括2780株細(xì)菌、121株真核微生物、107株古菌、2697株病毒和1186個(gè)質(zhì)粒。2.2基因tna和基因翻譯必需基因指能支持一個(gè)完整的生物體存活所必需的基因,包括編碼與DNA復(fù)制、RNA處理和修飾、解碼遺傳密碼的tRNA、翻譯組分和分子伴侶等蛋白的基因。目前必需基因確立的方法主要包括有3種。2.2.1使用生物信息技術(shù)的方法進(jìn)行基因敲除采用生物信息學(xué)的方法確立刪除對(duì)象,首先進(jìn)行必需基因分析:使用生物信息學(xué)必需基因在線數(shù)據(jù)庫(kù)(DatabaseofEssentialGenes,DEG,/deg/),用所研究菌株的全基因組堿基序列和數(shù)據(jù)庫(kù)中同類菌株的必需基因數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì),相似性在50%以上的可能為必需基因(可以結(jié)合實(shí)際的敲除結(jié)果,修正相似性百分量進(jìn)行比對(duì),相似性較高的為必需基因),在基因組的大片段敲除過(guò)程中需要避開這些基因。此在線數(shù)據(jù)庫(kù)為張春霆院士率領(lǐng)的天津大學(xué)生物信息研究中心所建。其次,進(jìn)行基因組島分析:使用生物信息學(xué)基因組島在線分析軟件(/GC-Profile/)對(duì)所研究菌株的全基因組堿基序列進(jìn)行分析,分析得到n個(gè)分割點(diǎn),將全基因組分成n+1個(gè)片段,這n+1個(gè)片段的G+C百分含量與全基因組G+C百分含量比較,差距較大者可能是基因組島,可能為外來(lái)的(水平轉(zhuǎn)移獲得的)基因,可以刪除。最后,進(jìn)行復(fù)制原點(diǎn)分析:使用生物信息學(xué)中的復(fù)制原點(diǎn)在線分析軟件(/Ori-Finder/),對(duì)所研究菌株的全基因組堿基序列進(jìn)行分析,可發(fā)現(xiàn)oriC的位置,可確定其大小,復(fù)制原點(diǎn)側(cè)翼基因需要保留?？傊?在選定刪除片段的時(shí)候,利用生物信息學(xué)的方法進(jìn)行預(yù)測(cè),但是,在實(shí)際操作中,還要結(jié)合實(shí)際情況進(jìn)行修正。2.2.2核心編碼區(qū)的基因?qū)傩赃x擇親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的同屬菌株全基因組序列,確定一個(gè)基因組的backbone,即保守核心編碼區(qū)。由于所選取菌株為同屬但親緣關(guān)系較遠(yuǎn),保守核心編碼區(qū)在進(jìn)化過(guò)程中能夠保存下來(lái)應(yīng)該是菌體生長(zhǎng)和基礎(chǔ)代謝所必需的。核心編碼區(qū)包含的基因被認(rèn)為是必需基因,保守區(qū)之外的基因則可能是和次級(jí)代謝相關(guān)的具有菌種特異性的非必需基因。MamoruKomatsu使用該方法,確立了Streptomycesavermitilis的必需基因。2.2.3初始代謝網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建采用被精簡(jiǎn)微生物的基因組數(shù)據(jù),利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù),可建立基因與蛋白之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系,將基因間的邏輯關(guān)系對(duì)應(yīng)于相應(yīng)酶的催化反應(yīng)上。從而,可構(gòu)建出初始代謝網(wǎng)絡(luò);將該網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)化成數(shù)學(xué)式,對(duì)模型進(jìn)行分析、模擬、驗(yàn)證和填補(bǔ),得到定量的、具有高精度預(yù)測(cè)能力的全基因組水平代謝網(wǎng)絡(luò)模型。進(jìn)一步建立調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。采用流平衡分析(FBA)、代謝調(diào)節(jié)最小化分析(MOMA)、調(diào)節(jié)的開關(guān)最小化(ROOM)以及含有二次線性規(guī)劃的動(dòng)態(tài)流平衡(DFBA-LQR)等網(wǎng)絡(luò)分析方法,結(jié)合已知必需基因信息,對(duì)被精簡(jiǎn)微生物進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬的基因組精簡(jiǎn),確立必需基因。2.3-ro系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)目前對(duì)細(xì)菌基因組進(jìn)行定點(diǎn)無(wú)痕修飾的方法日漸成熟,主要包括:傳統(tǒng)同源重組即利用宿主菌自身RecA修復(fù)系統(tǒng)的雙交換同源重組,利用λ-Red系統(tǒng)的同源重組,利用Cre/loxP的切除系統(tǒng)和Tn轉(zhuǎn)座系統(tǒng)。在大片段基因序列的敲除實(shí)驗(yàn)中,與傳統(tǒng)的同源重組相比,λ-Red系統(tǒng)具有很多優(yōu)點(diǎn):(1)需要的同源序列片段短,(2)打靶分子為線性,無(wú)需構(gòu)建打靶載體,(3)利用噬菌體重組酶介導(dǎo),大大提高了重組效率,(4)既可以完成單一堿基對(duì)的敲除,也可完成100kb以上的靶基因的敲除。但是,對(duì)于酵母以外的真菌,尚不能利用λ-Red系統(tǒng),它們的同源重組還需要借助宿主體內(nèi)自身的重組系統(tǒng)。Cre/loxP系統(tǒng)則會(huì)在敲除完成后留下一個(gè)loxP位點(diǎn),不是嚴(yán)格意義上的無(wú)痕。3最小基因組結(jié)構(gòu)生殖道支原體(Mycoplasmagenitalium)擁有自然界自由生長(zhǎng)的微生物中最小的基因組,長(zhǎng)度只有580kb,編碼大約480個(gè)蛋白。即使在生殖道支原體的基因組中也存在著約100個(gè)非必需基因,這些基因的失活不會(huì)對(duì)細(xì)胞的正常生命活動(dòng)產(chǎn)生影響。這激發(fā)了眾多研究者進(jìn)一步探索維持一個(gè)細(xì)胞正常生存的最小基因組。轉(zhuǎn)座子突變顯示,在實(shí)驗(yàn)室條件下,只需387個(gè)蛋白基因和43個(gè)結(jié)構(gòu)RNA基因就能維持生殖道支原體生存。大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、谷氨酸棒桿菌、粟酒裂殖酵母、釀酒酵母等一些微生物已經(jīng)完成基因組的初步精簡(jiǎn),刪除范圍從4%-29.7%不等,獲得的突變株出現(xiàn)了一些新的特性[19,20,21,22,23,24,25,26]。下面詳細(xì)介紹了幾株微生物基因組精簡(jiǎn)后,突變株合成產(chǎn)物能力提高的例證。3.1-ro學(xué)校清髓性基因片段的缺失和形成大腸桿菌是了解得最清楚、分析得最透徹的微生物,是遺傳學(xué)研究、生化研究和代謝模擬研究的模式生物。大腸桿菌是遺傳重組領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的宿主之一,在醫(yī)藥和發(fā)酵工業(yè)中用于生產(chǎn)重組蛋白、氨基酸和其他化學(xué)品。2001年,日本啟動(dòng)了MGF(Minimumgenomefactory)計(jì)劃,目標(biāo)即是構(gòu)建一株最小基因組的菌株作為細(xì)胞工廠。在該計(jì)劃中,EscherichiacoliK12的4.6Mb基因組被削減至3.6Mb,得到突變株MGF-01。在選定刪除片段時(shí),研究人員首先是對(duì)比了EscherichiacoliK12和Buchnerasp的基因組序列,相同的基因被認(rèn)為是必需基因。Buchnerasp是一種蚜蟲的內(nèi)共生菌,和Escherichiacoli有很近的親緣關(guān)系。它的基因組被認(rèn)為在與環(huán)境相適應(yīng)的過(guò)程中已經(jīng)比Escherichiacoli的基因組精簡(jiǎn)很多。同時(shí)維持Escherichiacoli在最小培養(yǎng)基中生存的基因也是必需基因,避開這些基因,且包含多于10個(gè)基因的核酸片段被選為敲除目標(biāo)。對(duì)于這些片段的敲除,HiroshiMizoguchi等人采用的是兩個(gè)連續(xù)的λ-Red介導(dǎo)的同源重組(圖1)。加有同源臂的鏈霉素敏感基因-蔗糖敏感基因-氯霉素抗性基因片段首先通過(guò)一輪的λ-Red同源重組代替靶基因,篩選氯霉素抗性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行第二步的同源重組。將整合的上下游同源臂片段通過(guò)第二輪λ-Red同源重組替換插入的片段。篩選鏈霉素抗性和蔗糖抗性的轉(zhuǎn)化子,獲得目的突變株MGF-01。在M9培養(yǎng)基中,該突變株在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速度和野生株相同,并且在野生株進(jìn)入穩(wěn)定期后,仍然生長(zhǎng),最終細(xì)胞密度是野生株的1.5倍。該研究組又將合成蘇氨酸的遺傳元件(△metA::thrABC-cat)整合進(jìn)突變株MGF-01和野生株的基因組中,發(fā)酵48h結(jié)果表明,突變株MGF-01蘇氨酸的合成能力是野生株的2倍,分別為10g/L和5g/L?；蚪M中非必需基因的刪除使其擁有了高于野生株的合成化合物的能力,這是構(gòu)建細(xì)胞工廠的一個(gè)良好開端。3.2基于序列的突變株枯草芽胞桿菌,是一種研究深入的微生物模式菌株,能夠分泌多種具有重要應(yīng)用價(jià)值的酶?？莶菅堪麠U菌廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域。Westers等報(bào)道了一株枯草芽胞桿菌突變菌株Δ6,該菌株通過(guò)刪除兩個(gè)原噬菌體(SPb,PBSX)減少了基因組的7.7%。然而,△6的表型特征表明其沒(méi)有獨(dú)特的性質(zhì)。2008年,TakuyaMorimoto等人通過(guò)精簡(jiǎn)枯草芽胞桿菌的基因組得到了一系列突變株,其中,MGB874缺失0.87Mb的基因序列,并表現(xiàn)了良好的特性。他們首先通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析,確定10kb以上的不編碼RNA和特殊蛋白質(zhì)的基因序列,并且排除所有已知的和可能的初級(jí)代謝基因,利用RecA介導(dǎo)的同源重組的方法(圖2),無(wú)痕敲除靶基因序列,其中包括噬菌體、次級(jí)代謝相關(guān)基因等。得到突變體后,研究人員檢測(cè)了該突變株生產(chǎn)耐熱堿性纖維素酶和堿性蛋白酶的能力。他們將構(gòu)建的蛋白酶表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入得到的突變株中。分析發(fā)現(xiàn),兩種蛋白酶的產(chǎn)量隨著缺失基因序列的增多而增大。MGB874發(fā)酵液中纖維素酶和蛋白酶的活性比野生型細(xì)胞高約1.7和2.5倍,而且蛋白酶生產(chǎn)期也被延長(zhǎng)。此外,MGB874細(xì)胞在培養(yǎng)液中麥芽糖消耗增強(qiáng),表明碳源的利用效率改善也是基因組減少導(dǎo)致的。3.3pcr調(diào)節(jié)的染色體分裂pcs技術(shù)啤酒酵母,幾個(gè)世紀(jì)以來(lái)用于酒精發(fā)酵工業(yè),如今也是一個(gè)用于生物學(xué)研究的模式生物。對(duì)6500個(gè)基因的單獨(dú)敲除,得到了維持啤酒酵母生長(zhǎng)的基礎(chǔ)基因。但這種方法得到的酵母突變體在發(fā)酵和適應(yīng)環(huán)境方面不盡如人意,不能完全像一個(gè)真核微生物一樣。為了研究有多少基因能維持酵母生存且同時(shí)能有效產(chǎn)生酒精,KirikoMurakami等人通過(guò)當(dāng)前先進(jìn)的PCR調(diào)節(jié)的染色體分裂(PCS)技術(shù)大規(guī)模缺失啤酒酵母的基因組,成功改造酵母染色體。選定靶位點(diǎn)后,研究人員用PCR調(diào)節(jié)的染色體分裂(PCS)技術(shù)敲除了啤酒酵母5%的基因組序列,實(shí)驗(yàn)原理可概括為下圖(圖3)。該技術(shù)的核心是裂解模塊,包括三部分:靶標(biāo)序列、兩端加有l(wèi)oxP位點(diǎn)的標(biāo)記物(marker)和可被修飾為端粒序列的(C4A2)6序列。裂解模塊轉(zhuǎn)化靶細(xì)菌,同源重組使染色體發(fā)生裂解,利用營(yíng)養(yǎng)型篩選突變體。移除標(biāo)記基因時(shí),表達(dá)Cre蛋白的pSH47質(zhì)粒轉(zhuǎn)化靶細(xì)菌,篩選酪氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷體,即為目的轉(zhuǎn)化子。對(duì)本研究得到的基因缺失體研究顯示,大約530kb的基因缺失不影響酵母的生長(zhǎng)與發(fā)酵,其中,突變體MFY1162比母本多產(chǎn)1.8倍的酒精。對(duì)基因表達(dá)譜的分析發(fā)現(xiàn),缺失體中代謝受到非正常的調(diào)節(jié)導(dǎo)致了更多的酒精和甘油的產(chǎn)生。該研究首次修整了酵母的基因組,并證明基因功能重組有益于酒精生產(chǎn)。3.4s基因組重離子生物學(xué)在突變體中的應(yīng)用鏈霉菌是重要的工業(yè)微生物,鏈霉菌屬的細(xì)菌能夠合成為數(shù)眾多的次級(jí)代謝產(chǎn)物,包括抗生素和一些對(duì)人類健康、獸藥研究和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有價(jià)值的化合物。這些化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣的代謝產(chǎn)物包括聚酮類、非核糖體合成多肽、細(xì)菌素類、萜類和氨基糖苷類化合物等,表現(xiàn)出抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤的作用,而且有抗高血壓和免疫抑制的功能。近年來(lái),科研人員對(duì)應(yīng)用工程菌異源合成次級(jí)代謝物有很大的興趣。工業(yè)上用來(lái)生產(chǎn)驅(qū)腸蟲劑阿佛菌素的Streptomycesavermitilis就是一株高效合成次級(jí)代謝產(chǎn)物的菌株,日本研究人員MamoruKomatsu等就通過(guò)減小S.avermitilis基因組來(lái)實(shí)現(xiàn)其高效合成異源次級(jí)代謝產(chǎn)物的目的。在他們的研究中,首先通過(guò)比較三株分類學(xué)上不同的鏈霉菌Streptomycesavermitilis、StreptomycescoelicolorA3和Streptomycesgriseus的基因組,發(fā)現(xiàn)一個(gè)6.28-6.50Mb核心保守區(qū)。和其他兩株菌不同的是,S.avermitilis的基因組是不對(duì)稱的,線性染色體的兩端分別有一個(gè)2Mb和0.5Mb的近端區(qū)域。MamoruKomatsu等推測(cè)這些近端區(qū)域和菌種特異的次級(jí)代謝有關(guān),它們的敲除應(yīng)該不會(huì)影響菌體的正常生長(zhǎng)和初級(jí)代謝。兩步雙交換同源重組首先被用來(lái)無(wú)痕敲除1.4Mb的片度(圖4)。大約2kb的同源臂連接在卡那霉素/新霉素抗性基因aph的兩側(cè),連接到pGM160Δaac(3)I::oriT,進(jìn)行第一步雙交換,基因aph替代靶位點(diǎn)。連有兩個(gè)同源臂的pGM160Δaac(3)I::oriT再次導(dǎo)入宿主,進(jìn)行第二次雙交換,消除抗性基因aph。采用該方法他們得到突變體SUKA2(Δ7,734-1,494,898nt),但是該方法假陽(yáng)性率高,應(yīng)用CreloxP的位點(diǎn)特異性重組是他們敲除的主要方