超聲波輔助提取啤酒廢酵母中的adh

超聲波輔助提取啤酒廢酵母中的adh

0基于啤酒廢酵母的adh提取工藝乙醇脫氫酶（adh）是氧化還原酶的第一個(gè)亞類，與-參考文獻(xiàn)相對(duì)應(yīng)。它以鈉d和鈉d或pq為酶，以十二烷基硫酸鈉和乙酰胺之間的反應(yīng)。這是一種含有鋅的酶。廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、食品等行業(yè)。目前，商品adh主要來(lái)自動(dòng)物肝臟，提取和提取過(guò)程相對(duì)成熟，但其資源有限、價(jià)格昂貴，無(wú)法滿足市場(chǎng)的需求。啤酒廠廢棄的啤酒酵母中含有大量sdh。在這項(xiàng)工作中，我們主要研究了從啤酒中提取sdh的過(guò)程，并為擴(kuò)建adh的來(lái)源提供了一種新的方法。降低adh的生產(chǎn)成本。1材料和方法1.1材料和設(shè)備(1)啤酒垃圾由西安漢斯啤酒廠提供.(2)藥物試劑輔酶Ⅰ(NAD+)(Sigma公司生產(chǎn)),磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙醇等均為分析純?cè)噭?(3)儀器、儀器和儀器HH-2超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(國(guó)華電器有限公司)、TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)、UV-9100紫外可見分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司)等.1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1adh酶活力測(cè)定ADH活性測(cè)定采用Vallec-Hoch法.將0.1mLADH酶液與3mLpH為8.5的磷酸鹽緩沖液混合,于37℃水浴預(yù)熱5min,然后加入0.4mL的2M乙醇和0.1mL的4.5mMNAD+溶液,37℃水浴反應(yīng)5min,立即置于沸水中滅活,于340nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值.空白對(duì)照用蒸餾水代替加NAD+,其余均相同.ADH酶活力(U/mL)定義:將ADH在37℃每分鐘氧化乙醇脫氫生成乙醛,即還原NAD+為NADH,在340nm處測(cè)定的吸光度變化0.001作為一個(gè)活力單位(U).1.2.2超聲輔助破碎細(xì)胞啤酒廢酵母經(jīng)反復(fù)凍融后離心濃縮,與一定體積的磷酸鹽緩沖液混合,再在低于4℃的條件下采用超聲波輔助的方法進(jìn)行細(xì)胞破碎,每超聲1s間歇3s,10000r/min離心15min,上清液在340nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值,計(jì)算ADH活力.1.2.3adh活力指標(biāo)在ADH提取實(shí)驗(yàn)中,固定其他條件,以提取液中ADH活力為指標(biāo),分別對(duì)料液比、樣品處理量、提取液pH、超聲波功率、超聲全程時(shí)間和提取液濃度進(jìn)行考察,以確定各影響因素的適宜水平.1.2.4正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇對(duì)ADH提取效果影響較大的因素,以提取液中ADH活力為指標(biāo),按照正交試驗(yàn)原理進(jìn)行正交設(shè)計(jì),每個(gè)水平設(shè)3個(gè)重復(fù),對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析和極差分析,以確定啤酒廢酵母中ADH提取的最優(yōu)方案.2結(jié)果與討論2.1不同因素對(duì)提議廢除啤酒廢物中的adh活性的影響2.1.1料液比例的確定在細(xì)胞超聲破碎工藝中,提取液用量一般為樣品處理量的3～5倍.但本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)不同料液比下所得的ADH活力進(jìn)行比較,最終確定以啤酒廢酵母量(w)∶提取液(v)為1∶2較為適宜.主要是由于實(shí)驗(yàn)所用材料為啤酒廠廢棄的啤酒酵母,成分比較復(fù)雜,酵母菌體數(shù)量相對(duì)較少.選用較高的料液比例有利于提高單位提取液中ADH的含量.2.1.2超聲輔助提取分別取10g和20g啤酒廢酵母,按照1∶2的比例用pH為8.5的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液對(duì)ADH進(jìn)行超聲輔助提取,超聲波功率250W,超聲全程時(shí)間10min.提取液中ADH活力的測(cè)定結(jié)果見表1.由表1可以看出,采用10g和20g啤酒廢酵母在相同條件下進(jìn)行超聲輔助提取時(shí),ADH活力分別為350U/mL和466U/mL,后者不僅提取出的ADH活性高,而且一次可以獲得較多的粗酶液,故后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均采用20g的樣品處理量.2.1.3提取液中adh活性測(cè)定取20g啤酒廢酵母,用不同pH的磷酸鹽緩沖液對(duì)ADH進(jìn)行提取,其他條件同2.1.2.提取液中ADH活性測(cè)定結(jié)果如圖1所示.由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,啤酒廢酵母中ADH提取的適宜緩沖液pH范圍為8.5～9.5,在此范圍內(nèi)ADH活性最高,升高或降低緩沖液的pH值均可導(dǎo)致ADH活力降低.2.1.4adh活性測(cè)定將20g啤酒廢酵母用pH為8.5的磷酸鹽緩沖液在不同功率的超聲波下進(jìn)行提取,其他條件同2.1.2.提取液中ADH活性測(cè)定結(jié)果如圖2所示.由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,適宜于啤酒廢酵母中ADH提取的超聲功率在320W左右.超聲波功率不同,ADH的提取結(jié)果差異較大.ADH為胞內(nèi)酶,較低的超聲波功率無(wú)法實(shí)現(xiàn)啤酒酵母細(xì)胞的充分破碎,ADH不能完全釋放出來(lái).但若超聲波功率太大,則產(chǎn)生的高溫會(huì)對(duì)ADH的活性造成影響,故在后續(xù)的ADH提取工藝中超聲波功率選定為320W.2.1.5超聲時(shí)間對(duì)adh活性的影響將20g啤酒廢酵母采用功率為320W的超聲波按不同處理時(shí)間進(jìn)行提取,其他條件同2.1.2.提取液中ADH活力的測(cè)定結(jié)果如圖3所示.由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,超聲處理全程時(shí)間不同時(shí)ADH的提取結(jié)果也有所不同,處理時(shí)間過(guò)短不利于酵母細(xì)胞完全破碎,處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)產(chǎn)熱升溫而使ADH活性降低,比較適宜的超聲全程時(shí)間在10min左右.故在后續(xù)的ADH提取工藝中,采用功率為320W的超聲波在全程時(shí)間10min下進(jìn)行實(shí)驗(yàn).2.1.6adh活性測(cè)定選用不同濃度的緩沖液,在功率為320W的超聲波下全程處理10min對(duì)20g啤酒廢酵母進(jìn)行提取,其他條件同2.1.2,ADH活性測(cè)定結(jié)果如圖4所示.由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,在所選的提取液濃度范圍內(nèi),ADH的提取效果隨著提取液濃度的增加而升高,但最終確定提取液濃度以0.08mol/L較為適宜.考慮到溫度較高時(shí)ADH活力下降較快,故整個(gè)提取過(guò)程是在冰浴狀態(tài)下進(jìn)行的,以維持提取液溫度在4℃以下.由于0.08mol/L磷酸鹽緩沖液在4℃以下時(shí)已接近飽和,因此繼續(xù)提高提取液濃度對(duì)提取ADH意義不大.2.2adh活力測(cè)定根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以提取液pH、超聲波功率和超聲全程時(shí)間為影響因素,提取液中ADH活力為考察指標(biāo),設(shè)計(jì)了L9(33)正交試驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2.2.2.1adh提取的最優(yōu)方案由正交試驗(yàn)表極差分析所得的極差值R的大小可以看出,3個(gè)因素對(duì)ADH提取效果的影響大小依次為A>B>C,即提取液pH>超聲波功率>超聲全程時(shí)間.比較正交表中各列的位級(jí)值大小可以得出ADH提取的最優(yōu)方案為A1B2C1,即提取液pH為8.5、超聲波功率為320W、超聲全程時(shí)間為10min.但此方案并未出現(xiàn)在上述正交表中,故需對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn).2.2.2adh活性測(cè)定取20g啤酒廢酵母,加入pH為8.5的0.08mol/L磷酸鹽緩沖液40mL,超聲波功率為320W,每超聲1s間歇3s,超聲全程時(shí)間10min,操作溫度控制在4℃以下.經(jīng)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn),測(cè)得提取液中ADH活力平均值為1806U/mL,高于正交表中的最高值1778U/mL,可見極差分析得到的提取方案可以作為啤酒廢酵母中ADH提取的最優(yōu)方案.3超聲輔助提取啤酒廢酵母(1)運(yùn)用超聲輔助的方法對(duì)啤酒廢酵母中的ADH進(jìn)行提取,得到的最優(yōu)工藝條件為:20g啤酒廢酵母中加入pH為8.5的0.08mol/L磷酸鹽緩沖液40mL,采用的超聲波功率為320W,每超聲1s間歇3s,超聲全程時(shí)間為10min,操作溫度控制在4℃以下.在此條件下,獲得的提取液中ADH活性最高,可以達(dá)到1806U/mL.(2)研究表明,ADH在溫度較高時(shí)活力容易損失,故ADH提取過(guò)程宜在低溫下進(jìn)行.將細(xì)胞凍融破碎法與超聲輔助提取工藝相結(jié)合用于啤酒廢酵母中ADH的提取,既可減少高溫對(duì)ADH活性的影