一測(cè)多評(píng)法測(cè)定丹參中4種丹參酮類成分

一測(cè)多評(píng)法測(cè)定丹參中4種丹參酮類成分

如何有效評(píng)估中醫(yī)的質(zhì)量是現(xiàn)代中醫(yī)研究的中心主題之一。中藥成分復(fù)雜,現(xiàn)行的用1~2種化學(xué)成分評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的模式,無法表征中藥化學(xué)成分的整體性和復(fù)雜性,不能有效地評(píng)價(jià)中藥的質(zhì)量。因此,應(yīng)逐步建立采用多指標(biāo)成分評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的新模式。但由于采用多指標(biāo)成分評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量需要有足夠數(shù)量的化學(xué)對(duì)照品,致使其在實(shí)際應(yīng)用中受到限制。針對(duì)這一矛盾,王智民等提出了中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)“一測(cè)多評(píng)”的新思路,即只采用1個(gè)對(duì)照品(供應(yīng)充足、容易獲得者),來實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)成分(對(duì)照品不能充足供應(yīng)者)的同步測(cè)定,并已成功運(yùn)用于人參、三七、關(guān)黃柏等藥材中多種成分的含量測(cè)定。丹參為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根莖,是臨床常用大宗中藥材之一。丹參藥材因品種、產(chǎn)地、采收期等的不同,致使其所含主要成分差異較大,因此應(yīng)嚴(yán)格控制丹參藥材的質(zhì)量。目前已有以多個(gè)丹參酮類成分的同步測(cè)定來評(píng)價(jià)丹參質(zhì)量的相關(guān)報(bào)道,但這種方法目前還難以推廣應(yīng)用,主要是由于丹參中這類成分的對(duì)照品供應(yīng)不足。筆者采用HPLC法,建立了以丹參酮IIA為對(duì)照品,同步測(cè)定丹參藥材中丹參酮IIA、丹參酮I、隱丹參酮和二氫丹參酮4種成分的一測(cè)多評(píng)法。1主要儀器和儀器Agilent1200系列高效液相色譜系統(tǒng)(A),Waters600-996高效液相色譜系統(tǒng)(W),色譜柱Shim-packPREP-ODS(H)KITC18(250mm×4.6mm,5μm,S,上海歐尼儀器科技有限公司),WelchMaterialC18(250mm×4.6mm,5μm,W,杭州漢澤儀器有限公司),AmethystC18-P(250mm×4.6mm,5μm,A,廣州市化玻貿(mào)易有限公司)。丹參酮IIA、丹參酮I、隱丹參酮、二氫丹參酮對(duì)照品均為自制(經(jīng)ESI-MS、NMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定),經(jīng)HPLC面積歸一化法測(cè)定,質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%。乙腈為色譜純(山東禹王實(shí)業(yè)有限公司),水為超純水,其他試劑均為分析純。10批丹參樣品分別購(gòu)自濟(jì)南市中魯醫(yī)院、中山大藥房、一笑堂大藥房、泉城大藥房、金日大藥房、澤生大藥房、魯醫(yī)南苑大藥房、漱玉平民大藥房、齊魯大藥房和神農(nóng)本草大藥房,經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院于宗淵研究員鑒定,均為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根莖。2方法和結(jié)果2.1流動(dòng)相0.2%乙酸色譜柱為Shim-packPREP-ODS(H)KITC18(250mm×4.6mm,5μm),流動(dòng)相為乙腈-0.2%乙酸(55∶45),體積流量1.0mL/min,柱溫30℃,檢測(cè)波長(zhǎng)270nm。在該色譜條件下,各待測(cè)成分分離度良好。色譜圖見圖1。2.2混合對(duì)照品溶液分別取丹參酮IIA、丹參酮I、隱丹參酮、二氫丹參酮對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇溶解,配制成含丹參酮IIA30μg/mL、丹參酮I40μg/mL、隱丹參酮30μg/mL、二氫丹參酮5μg/mL的混合對(duì)照品溶液,置棕色瓶?jī)?nèi),避光保存。2.3甲醇的用量取丹參藥材粉末(過60目篩)約0.3g,精密稱定,置圓底燒瓶中,精密加入甲醇50mL,稱定質(zhì)量,加熱回流1h,放冷,再稱定,用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,用0.45μm的微孔濾膜濾過,棄去初濾液,取續(xù)濾液,置棕色瓶?jī)?nèi),避光保存。2.4對(duì)照品進(jìn)樣量的確定取混合對(duì)照品溶液,分別稀釋1、4、8、12、16、20倍,配制成系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液,分別進(jìn)樣10μL,以峰面積積分值對(duì)各對(duì)照品的進(jìn)樣量進(jìn)行線性回歸,結(jié)果見表1。表明各對(duì)照品的進(jìn)樣量與峰面積積分值均呈良好線性關(guān)系。2.5密度規(guī)制丹參酮srd取購(gòu)于中山大藥房的丹參制備的供試品溶液,依法測(cè)定,連續(xù)進(jìn)樣6次,每次10μL,計(jì)算得丹參酮IIA、丹參酮I、隱丹參酮、二氫丹參酮峰面積的RSD依次為0.31%、0.43%、0.68%、0.38%。2.6溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)取購(gòu)于中山大藥房的丹參制備的供試品溶液,分別于室溫避光放置0、4、8、12、16、20、24h進(jìn)樣,計(jì)算得丹參酮IIA、丹參酮I、隱丹參酮、二氫丹參酮峰面積的RSD依次為0.40%、0.30%、1.1%、1.4%,表明供試品溶液于室溫避光放置24h內(nèi)穩(wěn)定。2.7質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定取購(gòu)于中山大藥房的丹參藥材粉末(過60目篩)6份,每份約0.3g,精密稱定,制備供試品溶液,依法測(cè)定,外標(biāo)法計(jì)算得丹參酮IIA、丹參酮I、隱丹參酮、二氫丹參酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD依次為1.3%、1.2%、1.6%、1.1%。2.8加樣回收率試驗(yàn)取購(gòu)于中山大藥房的丹參藥材粉末6份,每份約0.15g,精密稱定,按各成分在藥材中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同分別加入適量的對(duì)照品,制備供試品溶液,依法測(cè)定,分別計(jì)算各對(duì)照品的回收率。結(jié)果丹參酮IIA、丹參酮I、隱丹參酮、二氫丹參酮的平均回收率依次為99.5%、96.8%、98.7%、99.6%,RSD依次為1.6%、1.3%、0.90%、1.2%。2.9計(jì)算丹參酮iiia對(duì)不同基因型的相對(duì)校正因子的影響取“2.4”項(xiàng)下配制的系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液,各進(jìn)樣10μL,以丹參酮IIA為內(nèi)標(biāo),分別計(jì)算丹參酮IIA對(duì)丹參酮I、隱丹參酮和二氫丹參酮的相對(duì)校正因子,取均值。分別考察了W、A2種高效液相色譜系統(tǒng)和S、W、A3種色譜柱對(duì)各相對(duì)校正因子的影響,結(jié)果表明,不同儀器和色譜柱對(duì)各成分的相對(duì)校正因子無顯著影響,結(jié)果見表2。2.10保留時(shí)間差和相對(duì)保留時(shí)間為了在僅采用丹參酮IIA為對(duì)照品時(shí),能夠確認(rèn)丹參酮I、隱丹參酮和二氫丹參酮色譜峰的位置,從而通過獲得的相對(duì)校正因子同時(shí)計(jì)算3種成分的量,達(dá)到一測(cè)多評(píng)的目的,考察了采用不同儀器和色譜柱時(shí)丹參酮I、隱丹參酮和二氫丹參酮色譜峰與丹參酮IIA色譜峰間的保留時(shí)間差和相對(duì)保留時(shí)間2個(gè)參數(shù)。結(jié)果見表3、4。表明其他待測(cè)成分與丹參酮IIA保留時(shí)間差的RSD在1.7%~2.0%,相對(duì)保留時(shí)間的RSD在0.61%~1.7%,可見,與丹參酮IIA色譜峰間的保留時(shí)間差和相對(duì)保留時(shí)間均可作為其他3個(gè)待測(cè)成分色譜峰的定位參數(shù),相對(duì)保留時(shí)間較保留時(shí)間差的變異更小。2.11從測(cè)多評(píng)法和外標(biāo)法計(jì)算參酮的量取10批丹參藥材制備供試品溶液,進(jìn)樣測(cè)定,分別采用一測(cè)多評(píng)法和外標(biāo)法計(jì)算丹參藥材中丹參酮IIA、丹參酮I、隱丹參酮和二氫丹參酮的量,結(jié)果見表5。表明兩種方法所得結(jié)果無顯著差異。3參酮含量測(cè)定結(jié)果本實(shí)驗(yàn)采用HPLC外標(biāo)法測(cè)定了丹參藥材中的丹參酮IIA,同時(shí)測(cè)定并計(jì)算了丹參酮IIA與丹參酮I、隱丹參酮、二氫丹參酮的相對(duì)校正因子,用相對(duì)校正因子計(jì)算得到了丹參酮I、隱丹參酮、二氫丹