人骨肉瘤細(xì)胞mg63中foxm1基因表達(dá)及對細(xì)胞增殖與凋亡的影響

人骨肉瘤細(xì)胞mg63中foxm1基因表達(dá)及對細(xì)胞增殖與凋亡的影響

中國腫瘤防治雜志，2014年21（20）：1575-1579。骨肉瘤是最常見的原發(fā)惡性骨腫瘤,其惡性程度高,血行轉(zhuǎn)移發(fā)生早,具有較高的局部浸潤和早期轉(zhuǎn)移傾向,是導(dǎo)致患者死亡最主要的原因。ForkheadboxM1(FoxM1)是叉頭框轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,基因定位于12p13-3,長約23kb,普遍表達(dá)于增殖活躍的細(xì)胞,與DNA損傷修復(fù)、組織穩(wěn)態(tài)及細(xì)胞凋亡等過程密切相關(guān)。近年來研究表明,FoxM1在多種惡性腫瘤中均存在高表達(dá),其中包括肺癌、乳腺癌和前列腺癌等。FoxM1在人骨肉瘤中亦存在高表達(dá)現(xiàn)象。本研究以特異性siRNA干擾骨肉瘤細(xì)胞株FoxM1表達(dá),觀察其對細(xì)胞增殖與凋亡的影響,初步在細(xì)胞與分子水平了解FoxM1調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡的機(jī)制。1材料和方法1.1試驗兔抗兔模型人骨肉瘤細(xì)胞株MG63和SOSP-9607由第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院全軍骨腫瘤研究所保存。MEM和RPMI1640培養(yǎng)基購于美國Corning公司,胎牛血清購于美國Gibco,胰蛋白酶和四甲基偶氮唑鹽(MTT)購于美國Sigma公司,LipofectamineTM2000購于美國Invitrogen公司,二甲基亞砜(DMSO)購于美國Ventec公司,酶標(biāo)儀(Bio-Rad680,USA),低溫離心機(jī)(Beckman,USA);兔抗人FoxM1、β-actin(CST,USA)HRP標(biāo)記羊抗兔IgG購于美國Pierce公司,TotalRNAKitⅡ購于美國OMEGA公司,PrimeScriptRTreagentkit、RealtimePCRkit購于日本TaKaRa公司,FOXM1-siRNA及陰性對照siRNA序列由上海吉瑪公司合成。流式細(xì)胞術(shù)檢測在第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部免疫學(xué)教研室進(jìn)行。1.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染MG63和SOSP-9607細(xì)胞分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清的MEM和RPMI1640培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2中傳代培養(yǎng),并取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗。1.3sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳取生長狀態(tài)良好的MG63和SOSP-9607細(xì)胞,冰上裂解細(xì)胞提取總蛋白并BCA法進(jìn)行定量,調(diào)整樣品濃度。上樣30g/孔,行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,100V濕轉(zhuǎn)90min;含5%脫脂奶粉的TBST液封閉2h;抗FoxM1和抗β-actin4℃孵育過夜,相應(yīng)二抗室溫2h;洗滌后ECL顯色,置入儀器觀察,拍照記錄。1.4g膜轉(zhuǎn)染及細(xì)胞培養(yǎng)針對FoxM1的特異性siRNA正義鏈為5′-GGA-CCACUUUCCCUACUUUTT-3′,反義鏈為5′-AAA-GUAGGGAAAGUGGUCCTT-3′;陰性對照序列正義鏈為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,反義鏈為5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。轉(zhuǎn)染前將MG63細(xì)胞以每孔1×105的密度接種于6孔板中培養(yǎng),待細(xì)胞處于對數(shù)生長期并且融合度達(dá)60%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將MG63細(xì)胞分為實(shí)驗組、陰性對照組和空白對照組,前兩者分別轉(zhuǎn)染特異性siRNA和陰性對照siRNA,空白對照組細(xì)胞不處理,每組設(shè)3個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染時以O(shè)pti-MEM無血清培養(yǎng)基稀釋siRNA序列與LipofectaminTM2000,參照LipofectaminTM2000說明書進(jìn)行,轉(zhuǎn)染終體積為2mL/孔,siRNA轉(zhuǎn)染濃度為100nmol/L,轉(zhuǎn)染后8h換液,添加含胎牛血清10%的培養(yǎng)基。實(shí)驗重復(fù)3次。1.5rt-pcr檢測于轉(zhuǎn)染后72h收集各實(shí)驗組細(xì)胞,提取總RNA,采用SYBRGreenⅠ染料法檢測各組細(xì)胞FoxM1基因表達(dá)水平。FoxM1基因PCR引物序列上游為5′-G-AAGAACTCCATCCGCCACA-3′,下游為5′-GCCT-TAAACACCTGGTCCAATGTC-3′;β-actin引物序列上游為5′-TGGCATTGTTACCAACTGGGTC-3′,下游為5′-TCACGGTTGGCCTTAGGGTTC-3′。按熒光實(shí)時定量RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行,PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性6min,95℃變性10s,60℃退火1min,共進(jìn)行40個循環(huán);循環(huán)結(jié)束后71℃保溫30s,所得結(jié)果進(jìn)行讀數(shù)分析。采用相對定量法,分析實(shí)驗組、陰性對照組及空白對照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后的ΔCt值,計算ΔΔCt,進(jìn)而換算為2-ΔΔCt(設(shè)空白對照組表達(dá)量為1),即為轉(zhuǎn)染48h后各組FoxM1相對表達(dá)量。1.6總蛋白的提取采用蛋白質(zhì)印跡法檢測。轉(zhuǎn)染后72h收集各組細(xì)胞各3孔,裂解并提取總蛋白,其余步驟同實(shí)驗1.3。各組蛋白表達(dá)的灰度值利用QuantityOne進(jìn)行測定,以FoxM1蛋白與β-actin蛋白條帶灰度值的比值作為FoxM1基因的蛋白表達(dá)水平。1.7實(shí)驗細(xì)胞和人工誘導(dǎo)的活性人基因文庫建立采用MTT法檢測,實(shí)驗分組同1.4。將MG63細(xì)胞以8×103個/孔接種于96孔板培養(yǎng),每組細(xì)胞設(shè)4個復(fù)孔,周邊孔以無菌雙蒸水代替,共鋪4塊96孔板,培養(yǎng)過夜,于對數(shù)生長期按照實(shí)驗1.4轉(zhuǎn)染特異性siRNA及陰性對照siRNA。在轉(zhuǎn)染后24、48、72和96h各取1塊96孔板,加入新鮮MTT溶液20μL/孔;37℃孵育4h后,避光小心吸取上清液,每孔加入200μLDMSO溶解,酶標(biāo)儀中震蕩10min,在490nm(參考波長630nm)處測量并記錄每孔的光密度A值(A490)。每組細(xì)胞4復(fù)孔光密度A值取平均值,以時間為橫坐標(biāo),A平均值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖曲線。實(shí)驗重復(fù)3次。1.8細(xì)胞凋亡檢測采用流式細(xì)胞儀檢測,實(shí)驗分組同1.4。轉(zhuǎn)染后72h用0.25%胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞,培養(yǎng)基洗滌1次,AnnexinⅤ-PI法上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡。實(shí)驗重復(fù)3次。1.9多因素方差分析采用SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料以ue0af±s表示,對多個樣本均數(shù)進(jìn)行完全隨機(jī)設(shè)計的單因素方差分析(One-wayANOVA),各均數(shù)間兩兩比較行LSD-t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。2.結(jié)果2.1基因發(fā)現(xiàn)福斯圖1蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示,在人骨肉瘤細(xì)胞株MG63和SOSP-9607中存在FoxM1基因的表達(dá)。2.2各組機(jī)構(gòu)間增強(qiáng)黨員社區(qū)開發(fā)ccm1mrna的表達(dá)水平比較圖2Real-timePCR檢測結(jié)果顯示,實(shí)驗組、陰性對照組和空白對照組FoxM1mRNA表達(dá)水平分別為0.39±0.09、0.91±0.07和0.96±0.08,3組間FoxM1mRNA表達(dá)水平不同,F=46.22,P<0.001;實(shí)驗組FoxM1mRNA表達(dá)水平顯著低于陰性對照組,t=7.92,P<0.001,比陰性對照組下降64%;也低于空白對照組,t=8.68,P<0.001;陰性對照組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,t=0.76,P=0.475。2.3組間保血蛋白表達(dá)水平比較圖3蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示,實(shí)驗組、陰性對照組和空白對照組FoxM1蛋白表達(dá)水平分別為0.31±0.06、0.81±0.10和0.89±0.09,3組間FoxM1蛋白表達(dá)水平不同,F=40.98,P<0.001;實(shí)驗組FoxM1蛋白表達(dá)水平顯著低于陰性對照組,t=7.20,P<0.001,比陰性對照組下降約60%;也低于空白對照組,t=8.35,P<0.001;陰性對照組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,t=1.15,P=0.29。2.4各組間增殖率圖4MTT檢測結(jié)果顯示,實(shí)驗組、陰性對照組和空白對照組MG63細(xì)胞增殖率分別為0.36±0.03、0.61±0.02和0.65±0.02,3組間增殖率不同,F=130.77,P<0.001;實(shí)驗組增殖率顯著低于陰性對照組,t=12.86,P<0.001;也低于空白對照組,t=14.92,P<0.001;陰性對照組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,t=2.06,P=0.085。2.5各組凋亡率的情況圖5流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,實(shí)驗組、陰性對照組和空白對照組MG63細(xì)胞凋亡率分別為(13.69±1.15)%、(2.38±0.90)%和(2.87±0.86)%,3組間凋亡率不同,F=128.075,P<0.001;實(shí)驗組凋亡率顯著高于陰性對照組,t=14.16,P<0.001;也高于空白對照組,t=13.54,P<0.001;陰性對照組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,t=0.61,P=0.562。3核心分子—討論FoxM1作為人FOX轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員,是經(jīng)典的增殖相關(guān)因子,與PIK-1、Survivin和CDC25B等有絲分裂因子相互作用調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程,進(jìn)而影響細(xì)胞增殖與凋亡。FOXM1表達(dá)水平與細(xì)胞增殖密切相關(guān),其異常高表達(dá)對腫瘤細(xì)胞不可控性的惡性增殖意義重大,在惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用,涉及腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、耐藥與損傷修復(fù)等。Nakamura等報道,在127例急性髓細(xì)胞白血病(acutemyeloidleukemia,AML)臨床標(biāo)本中均存在FoxM1的過表達(dá),并可調(diào)控Survivin和CyclineB等周期相關(guān)蛋白的表達(dá);Gialmanidis等報道,FoxM1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)明顯高于癌旁正常肺組織,并與PTCH1和GLI1等HedgeHog信號通路蛋白相關(guān),而后者與腫瘤的分級相關(guān);Sun等研究證實(shí),FoxM1的表達(dá)與肝癌分期、分級和大小等密切相關(guān),可一定程度上提示患者的預(yù)后;Ahmad等研究發(fā)現(xiàn),乳腺癌細(xì)胞中FoxM1的過表達(dá),可使細(xì)胞的增殖速度明顯提高,侵襲、轉(zhuǎn)移能力明顯增強(qiáng);與此同時,FoxM1與腫瘤的藥物敏感性密切相關(guān),Gartel研究報道,不同腫瘤細(xì)胞株中加入噻唑類抗生素可通過抑制FoxM1的表達(dá)而加速細(xì)胞凋亡,提示FoxM1存在成為抗腫瘤藥物作用靶點(diǎn)的可能。隨著骨肉瘤臨床與基礎(chǔ)研究的進(jìn)步,目前治療以新輔助化療支持下的保肢綜合治療為主,使患者的5年生存率有了明顯的提高,并改善了患者的術(shù)后生活質(zhì)量,盡管如此,我國骨肉瘤患者5年生存率為7.5%~77.6%,平均生存率為64.0%。近年來,骨肉瘤分子靶向治療取得了一定的研究成果,出現(xiàn)了多個治療靶點(diǎn),但療效尚不夠理想,基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化率還很低。因此,探索骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的重要相關(guān)分子,尋找誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的新藥物,對骨肉瘤的治療具有重要意義。近年來研究表明,FoxM1在骨肉瘤中亦存在異常高表達(dá)現(xiàn)象,Wang等研究指出,在骨肉瘤細(xì)胞中FoxM1通過活化JNK1調(diào)節(jié)細(xì)胞周期;Grant等報道,在骨肉瘤細(xì)胞株中FoxM1可激活多個G2/M期和S期特異性基因的啟動子,從而對骨肉瘤的細(xì)胞增殖起到調(diào)控作用。但FoxM1影響骨肉瘤發(fā)生與發(fā)展的分子機(jī)制仍未完全闡釋。RNAi干擾技術(shù)是一項近年來逐漸成熟的生命科學(xué)技術(shù),可特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá),被廣泛應(yīng)用于探索基因功能及惡性腫瘤的基因治療等眾多領(lǐng)域。本研究采用蛋白質(zhì)印跡法檢測到在兩種骨肉瘤細(xì)胞株MG63和SOSP-9607中存在FoxM1的表達(dá),并利用siRNA干擾技術(shù)對FoxM1在細(xì)胞增殖與凋亡中的作用進(jìn)行了初步探討,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗組細(xì)胞轉(zhuǎn)染特異性siRNA后,與轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA的對照組和空白對照組細(xì)胞相比,FoxM1在mRNA和蛋白水平表達(dá)顯著下調(diào),增殖率顯著受到抑制,細(xì)胞凋亡明顯增加。這與已報道的文獻(xiàn)結(jié)果相吻合。其可能作用機(jī)制是FoxM1蛋白與PIK-1、Survivin和CDC25B等有絲分裂因子相互作用,阻斷細(xì)胞周期,