日本鰻皮中的纖維蛋白和小清蛋白的分離純化及表達分析

日本鰻皮中的纖維蛋白和小清蛋白的分離純化及表達分析

食物過敏主要是由于食物過敏刺激身體免疫反應(yīng)引起的ige誘導(dǎo)過敏。調(diào)查顯示有1%～2%的成年人對食物過敏,兒童的食物過敏發(fā)生率達到8%。一般來說,食物中90%的過敏原是蛋白質(zhì),這些蛋白質(zhì)能耐受食品加工、加熱和烹調(diào),能抵抗胃腸道消化酶并穿過腸道黏膜表面而被吸收,從而引發(fā)蕁麻疹、哮喘、嘔吐、腹瀉、過敏性休克等癥狀,嚴(yán)重的過敏反應(yīng)甚至危及生命。研究表明魚類小清蛋白能引起IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng),是魚類主要過敏原。小清蛋白分子量約為12ku,是一種鈣離子結(jié)合型水溶性蛋白,對熱、化學(xué)變性以及蛋白水解酶都比較穩(wěn)定,主要存在于魚類白色肉中。膠原蛋白也是魚類過敏原,直接食用會產(chǎn)生嚴(yán)重的健康問題。魚類膠原蛋白主要為I型,是白色、不透明、無支鏈的纖維型蛋白質(zhì),由三條分子量約100ku的α鏈形成的螺旋結(jié)構(gòu)。以日本鰻鱺(Anguillajaponica)為研究對象,從魚皮和魚肉中純化得到膠原蛋白,從魚肉中純化得到小清蛋白,應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測定、免疫印跡分析和體外模擬胃液消化實驗分析目標(biāo)蛋白的免疫原性和消化穩(wěn)定性。1材料和方法1.1準(zhǔn)蛋白、抗水劑、豬胃蛋白酶及豬胃蛋白酶日本鰻鱺購自廈門市集美菜市場?，F(xiàn)殺取肉,置于-20℃保存?zhèn)溆?。SDS所用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白為Fermentas公司產(chǎn)品,Western-blotting所用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白為NewEnglandBioLab公司產(chǎn)品,DEAE-Sepharose為GEHealthcare公司產(chǎn)品,山羊抗人IgE-HRP和小鼠抗蛙小清蛋白單克隆抗體為Sigma公司產(chǎn)品,兔抗小鼠IgG-HRP為Denmark公司產(chǎn)品,山羊抗兔IgG-HRP為Pierce公司產(chǎn)品,兔抗鯊魚膠原蛋白多克隆抗體及豬胃蛋白酶由本研究室制備,13份魚類過敏患者血清及無過敏正常人對照血清由廈門市第二醫(yī)院和集美大學(xué)醫(yī)療中心提供,13位過敏患者均有典型的過敏病史,主要癥狀包括蕁麻疹、哮喘、過敏性鼻炎等。1.2nacl溶液的制備將新鮮魚肉和魚皮分別放于10倍體積0.1mol/LNaOH中組織搗碎,4℃攪拌1d,4℃,16000×g,離心15min,去上清。沉淀溶于10%正丁醇,充分勻漿,4℃攪拌12h,4℃,12000×g,離心10min,去上清。超純水洗3～4次,離心去上清。沉淀溶解于0.5mol/LHAc,充分勻漿,4℃攪拌3d,4℃,16000×g,離心20min,去沉淀,上清用4mol/LNaCl緩慢鹽析到NaCl最終濃度為0.9mol/L,4℃,16000×g,離心20min。沉淀用0.5mol/LHAc復(fù)溶,0.1mol/LHAc為外液透析3d,每天換液一次,透析后樣品凍干。1.3粗提魚類肌漿蛋白的制備魚類過敏原小清蛋白主要存在于魚肉肌漿蛋白中。稱取60g魚肉,剁碎,加入10倍體積(v/w)冰冷的20mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0),用組織搗碎機搗碎(15s×5次,中間間隔1min),將懸浮液于8000×g離心10min,上清即為粗提的魚肉肌漿蛋白。將制備的粗提魚肉肌漿蛋白,置于100℃水浴加熱10min,冷卻至室溫,然后于15000×g離心15min,所得上清進行70%～100%的飽和硫酸銨鹽析,離心后所得沉淀溶于適量20mmol/LTris-HCl(pH7.5);20mmol/LTris-HCl(pH7.5)透析24h,期間更換3次透析液;透析后溶液于10000×g離心10min,取上清上樣于預(yù)先平衡好的陰離子交換柱DEAE-Sepharose,然后用緩沖液充分流洗未吸附蛋白(流速1mL/min),流洗到蛋白濃度約為0時,用0～0.5mol/LNaCl進行線性梯度洗脫吸附蛋白,3mL/管收集,測A280和A220。1.4電泳槽內(nèi)tis-hcl-l-1,tSDS參照Laemmli法進行。雙向電泳操作分為兩部分,第一部分是等電聚焦,第二部分是SDS。等點聚焦:將蛋白樣品、水合液(7mol/L尿素、2mol/L硫脲及2%CHAPS)、1mol/LDTT、pH4～7的兩性電解質(zhì)及溴酚藍以一定比例混合配制為150μL上樣液,混勻后取125μL上樣液點樣于電泳槽兩極間,將膠條放入電泳槽中,膠條酸性端對應(yīng)電泳槽正極,堿性端對應(yīng)電泳槽負(fù)極,取一定量的甘油覆蓋電泳槽,蓋上蓋子將電泳槽置于等點聚焦電泳儀中,于20℃下進行等點聚焦。等電聚焦結(jié)束之后,取出膠條,超純水沖洗、吸干,將膠條先后置于含2%DTT及2.5%IAA的平衡緩沖液(含6mol/L尿素、2%SDS、50mmol/LpH8.8的Tris-HCl緩沖液、20%甘油及0.002%溴酚藍)中,分別平衡20min。然后進行SDS電泳。1.5小鼠抗蛙小清蛋白的檢測Western-blotting依照Towbin法,一抗為1∶300稀釋的兔抗鯊魚膠原蛋白多克隆抗體,二抗為1∶1000稀釋的山羊抗兔IgG-HRP,二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine,DAB)顯色。Dot-blot:剪兩塊邊長約為5mm的正方形硝酸纖維素膜(NC膜),做好標(biāo)記。將蛋白分別點樣在NC膜中央。點樣結(jié)束后,用5%脫脂奶室溫下封閉1.5h。TBST洗膜5min×3次,加入稀釋的一抗(1∶2000稀釋的小鼠抗蛙小清蛋白單克隆抗體,或1∶5稀釋的魚類過敏患者血清),4℃反應(yīng)16h。TBST洗膜5min×5次,加入稀釋的二抗(1∶2000稀釋的兔抗小鼠IgG-HRP,或1∶2000稀釋的羊抗人IgE-HRP),在室溫下反應(yīng)2h。TBST洗膜5min×5次,DAB顯色30min。1.6血清tbt-t培育將蛋白樣品(200ng,100μL/孔)于4℃包被16h,TBST洗滌(5×每孔200μL)。加入5%脫脂奶(每孔200μL)于37℃封閉1.5h,TBST洗滌(3×每孔200μL)。加入1∶5稀釋的魚類過敏患者血清(每孔50μL)于37℃孵育2.5h,TBST洗滌(5×每孔200μL)。加入1∶2000稀釋的羊抗人IgE∶HRP(每孔100μL)于37℃孵育2h,TBS-T清洗(5×每孔200μL)。TMB(每孔100μL)避光顯色20min,2mol/L硫酸溶液(每孔50μL)終止反應(yīng),酶標(biāo)儀測OD450值。1.7外glf的消化SGF參照美國藥典方法配制,參與消化反應(yīng)的胃蛋白酶活力為8185U/mg蛋白,1L胃液中含NaCl2g,用HCl調(diào)pH1.2。體外SGF消化參照文獻的方法:在2只玻璃試管中加入900μLSGF,于37℃預(yù)熱15min。分別向兩只試管中加入1mg/mL的蛋白80μL,樣品試管立即加入20μL酶液(蛋白和酶比例為5∶1),對照試管加入未加酶的等體積模擬胃液。在37℃水浴鍋中振蕩反應(yīng),分別在反應(yīng)0、1、5、15、30、60、120min后取出20μL反應(yīng)液于含有10μL終止液(Na2CO3)的離心管中,混勻使其中止反應(yīng),置于冰上。2結(jié)果2.1微量元素和鏈分子量經(jīng)過堿溶、酸溶、鹽析、凍干等方法分別純化得到日本鰻鱺魚皮和魚肉的膠原蛋白(圖1-A),魚肉和魚皮的膠原蛋白很相似,包括兩條α亞基(α1和α2)和1條β鏈,α1鏈分子量約為120ku,α2鏈分子量約為110ku,β鏈分子量約為250ku。應(yīng)用兔抗鯊魚膠原蛋白多克隆抗體的Western-blotting(圖1-B)結(jié)果顯示,日本鰻鱺膠原蛋白可與兔抗鯊魚膠原蛋白多克隆抗體發(fā)生特異性雜交,證實從日本鰻鱺中純化的目標(biāo)蛋白樣品確為膠原蛋白。2.2日本肉肌蛋白的2-東南角制備的日本鰻鱺魚肉肌漿蛋白經(jīng)過70%～100%的硫酸銨分級鹽析,透析后上樣于DEAE-Sepharose陰離子交換柱,用0～0.5mol/LNaCl進行線性梯度洗脫。經(jīng)過DEAE-Sepharose柱層析后,小清蛋白分為兩種亞型,未吸附部分得到的小清蛋白為PV-Ⅰ型,吸附部分得到的小清蛋白為PV-Ⅱ型(圖2)。SDS電泳分析顯示,日本鰻鱺魚肉肌漿蛋白在110、52、50、41、35、30、28、11ku有特征蛋白(圖3,泳道1所示)。經(jīng)過100℃水浴加熱后,所提取的肌漿蛋白只剩下位于11ku左右的兩條分子質(zhì)量非常接近的條帶,還有30ku附近一條很模糊的條帶(圖3,泳道2所示)。圖3泳道3是經(jīng)過70%～100%硫酸銨鹽析,再經(jīng)過24h20mmol/LTris-HCl(pH7.5)透析后的樣品,從圖中可見到在30ku和25ku處仍有模糊的條帶。經(jīng)DEAE-Sepharose陰離子交換柱層析后,分子量位于11ku附近的兩條條帶被分開:分子量較高的蛋白未被吸附,為PV-Ⅰ;分子量較低的蛋白被吸附,為PV-Ⅱ。日本鰻鱺兩種亞型小清蛋白的2D分析結(jié)果顯示(圖4),PV-Ⅰ型分子量約為12ku,pI約為5.3;PV-Ⅱ型分子量約為11.5ku,pI約為5.0。以小鼠抗蛙小清蛋白單克隆抗體(1∶2000稀釋)作為一抗,HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG(1∶2000稀釋)作為二抗,分別通過Dot-blot對日本鰻PV-Ⅰ和PV-Ⅱ進行鑒定。結(jié)果如圖5所示,純化的PV-Ⅰ和PV-Ⅱ都與小鼠抗蛙小清蛋白單克隆抗體發(fā)生特異性雜交斑點,證實二者都是小清蛋白,且是不同的兩個亞型。2.3羊抗人ige陽性對照實驗結(jié)果分別以純化的日本鰻鱺膠原蛋白和小清蛋白為抗原包被在96孔聚苯乙烯平板上,魚類過敏患者血清作為一抗(1∶5稀釋),以無過敏的正常人血清為陰性對照,與1∶2000稀釋的羊抗人IgE-HRP反應(yīng)后,TMB顯色后OD450值如表1所示。無過敏的正常人血清中由于缺少與小清蛋白特異性結(jié)合的IgE,幾乎沒有顏色反應(yīng),450nm處的吸光值很低;魚類過敏患者陽性血清在450nm處的吸光值為無過敏正常人血清的兩倍以上,且純化的CO和PV與不同的魚類過敏患者陽性血清IgE發(fā)生特異性反應(yīng),二者無免疫交叉反應(yīng)?！だm(xù)表1·2.4pv-、ve-、dot-blct不同陽性患者血清中抗氧化酶活性的變化純化的日本鰻鱺膠原蛋白與3份魚類過敏患者血清(編號為9666、5277、0149)的Dot-blot出現(xiàn)斑點,PV-Ⅰ與4份魚類過敏患者血清(編號為6415、5588、1030、1529)的Dot-blot出現(xiàn)斑點,PV-Ⅱ與6份魚類過敏患者陽性血清(編號為8807、7071、8277、4989、0612、3132)的Dot-blot出現(xiàn)斑點,而無過敏的正常人血清的Dot-blot沒有顏色反應(yīng)。2.5肌漿蛋白的sgf消化表達日本鰻鱺膠原蛋白的SGF消化結(jié)果如圖6-A,β鏈分解速率很快(1min分解完全),α1鏈降解較慢(1h分解完全)。降解產(chǎn)物主要出現(xiàn)在97～116ku、80～97ku和66～97ku三段內(nèi),97～116ku之間的降解產(chǎn)物又在1h出現(xiàn)明顯分解,80～97ku之間的降解產(chǎn)物隨著時間的延長而減少,66～97ku之間的降解產(chǎn)物隨著時間的延長而增加。肌漿蛋白的SGF消化結(jié)果見圖6-B,隨著消化時間的延長,40ku處的蛋白被逐漸分解;PV在肌漿蛋白中的含量很高,其產(chǎn)生的降解條帶也被逐漸分解;肌漿蛋白在25ku和16ku處的條帶分別在15min和30min就被完全分解。相對于肌漿蛋白中的其他蛋白,PV的分解時間明顯延長,消化30～60min仍可觀察到PV及其小分子量的降解產(chǎn)物。3模擬消化小清蛋白的模擬檢測國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)了魚類特異性過敏原為膠原蛋白和小清蛋白。其中魚類膠原蛋白主要有Ⅰ型和Ⅴ型,本文采用堿溶、酸溶、鹽析、凍干等方法純化得到日本鰻鱺Ⅰ型膠原蛋白,與文獻中的膠原蛋白組成相同。魚皮與魚肉膠原蛋白的組成也十分相似,均含有一個β亞基,它的大小約為250ku;同時也存在著兩條α亞基,分子量約為120ku與110ku,純化的膠原蛋白可被兔抗鯊魚膠原蛋白多克隆抗體特異性識別。日本鰻鱺膠原蛋白的體外模擬胃液消化分解顯示,β亞基1min就被消化降解,而α亞基在1h的消化降解才明顯,消化產(chǎn)物主要在66～116ku之間,結(jié)果表明膠原蛋白具有較高的消化穩(wěn)定性。本文采用加熱、飽和硫酸銨分級鹽析、DEAE-Sepharose陰離子交換層析等方法純化得到兩種亞型的小清蛋白(PV-Ⅰ和PV-Ⅱ)。純化的兩種亞型日本鰻鱺小清蛋白均可與鼠抗蛙小清蛋白單克隆抗體發(fā)生特異性雜交反應(yīng)。對實驗中純化得到的兩種類型的小清蛋白進行雙向電泳分析,可知二者都為酸性蛋白,且等電點接近,PV-Ⅰ型分子量約為12ku,pI約為5.3;PV-Ⅱ型分子量約為11.5ku,pI約為5.0。接下來將對兩種類型的小清蛋白進行氨基酸測序,然后同GenBank數(shù)據(jù)庫中的日本鰻鱺小清蛋白序列(BAF98922)進行比對,分析其同源性并確定蛋白類型。日本鰻鱺小清蛋白的體外模擬胃液消化分解顯示,消化30～60min仍可觀察到小清蛋白及小分子量的降解產(chǎn)物,結(jié)果表明小清蛋白同樣具有較高的消化穩(wěn)定性,該結(jié)果與我們的前期報道相似。值得指出的是,應(yīng)用13份魚類過敏患者陽性血清的ELISA和免疫印跡分析結(jié)果一致