羅伊氏乳桿菌的研究進展

羅伊氏乳桿菌的研究進展

近年來，抗生素在人類和動物中的廣泛使用，甚至濫用現(xiàn)象日益明顯。長期使用抗生素會使人和動物腸道內的正常菌群失調,影響機體免疫功能的形成,甚至因長期濫用抗生素產生了具有多重抗藥性的“超級細菌”。因此,尋找抗生素的替代品成為人類未來生存和發(fā)展的緊迫任務。益生菌可改善宿主微生態(tài)平衡,抑制病原菌生長,提高宿主免疫力和健康水平。羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)是目前已報道的幾乎天然存在于所有脊椎動物和哺乳動物腸道內的乳酸菌。羅伊氏乳桿菌對腸黏膜具有很強的黏附能力,可改善腸道菌群分布,拮抗有害菌定植,避免罹患腸道疾病;羅伊氏乳桿菌能產生一種被稱為“羅伊氏菌素(Reuterin)”的非蛋白質類廣譜抗菌物質,能廣泛抑制革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母、真菌和病原蟲等的生長。羅伊氏乳桿菌益生菌制劑可改善人體機能,提高免疫力從而促進人體健康。我國衛(wèi)生部于2003年批準了羅伊氏乳桿菌可作為人類保健品的微生物菌種,且該菌已是國際上公認的新型益生乳酸菌,具有很高的理論研究和生產應用價值。對羅伊氏乳桿菌的研究早在20世紀80年代就已開始,對其各種益生功能的研究至今仍在繼續(xù),且新的研究成果層出不窮,使人們對羅伊氏乳桿菌的益生功能有了更全面的認識。本文將通過對羅伊氏乳桿菌良好的腸道定植能力和其產生的羅伊氏菌素的介紹,闡明其可能的益生作用機理,同時重點介紹羅伊氏乳桿菌促進人類和動物健康功能的研究進展。1碳黏附素及分子活性細菌黏附是一個非常復雜的細菌與宿主細胞相互作用的過程。細菌表面的黏附素與宿主細胞表面的相應受體結合之后,細菌便能牢固地黏附于宿主細胞上,并在該局部組織定居,大量繁殖。而腸道菌群在宿主腸道中的定植就是通過細菌的黏附性來實現(xiàn)的。因此,益生菌能否黏附于宿主腸道黏膜細胞表面形成穩(wěn)定的優(yōu)勢菌群是發(fā)揮其眾多生理功能的必要前提,而不能黏附于腸道黏膜細胞的細菌只能是過路菌而無法充分發(fā)揮其生理功能。羅伊氏乳桿菌是人和動物胃腸道中天然存在的乳桿菌之一,可承受胃酸和膽汁的作用而到達小腸的上部并黏附于小腸壁。對該菌黏附及定植能力的研究表明,羅伊氏乳桿菌細胞外存在黏附素,使其對宿主的黏膜黏液以及腸黏膜上皮細胞均表現(xiàn)較強的黏附能力。黏附素為乳酸菌表面普遍存在的結構成分,其主要成分多為分泌蛋白、糖蛋白、黏多糖類物質等。Miyoshi等用Caco-2細胞進行體外黏附模擬實驗,證明羅伊氏乳桿菌104R存在一種表面蛋白MapA,其不僅參與黏膜黏液的黏附,而且同時參與腸上皮細胞的黏附。Roos和Jonsson研究表明羅伊氏乳桿菌1063可以編碼一種358kDa的蛋白質,這種蛋白質可促進羅伊氏乳桿菌與黏膜黏液的黏附,而不同株羅伊氏乳桿菌是否能編碼這種蛋白質對于該菌株與黏膜黏液的粘附強弱具有非常重要的作用。羅伊氏乳桿菌在腸道中的定植具有普遍性,目前還沒有研究證明其定植位點具有特異的選擇性,即無論對腸黏膜黏液,還是腸上皮細胞等多部位的體內實驗及體外實驗的Caco-2細胞系都可以檢測到羅伊士乳桿菌的定植。Bjorkman的研究表明羅伊氏乳桿菌也可黏附在人結腸的上皮細胞。Jacobsen等選擇47株乳酸桿菌通過設定特定篩選條件:pH2.5,膽鹽濃度0.3%,對Caco-2細胞的黏附及是否抑制腸道致病菌而不抑制正常菌群等條件,從中篩選理想的益生菌。他們的研究結果顯示只有5株符合以上條件,其中三株可以在人體中很好地定植,這三株中就包括羅伊氏乳桿菌,而且羅伊氏乳桿菌是這三株中唯一既具有很強的抑制病原微生物的能力又不會對腸道中正常菌群造成抑制的乳酸桿菌。另外,某些羅伊氏乳桿菌不僅可以黏附定植于腸道中,而且其菌體還可以分泌胞外物質抑制腸道致病菌的黏附定植。羅伊氏乳桿菌104R可以黏附于豬回腸的黏液層,而且還能分泌一種大小為1700kDa的胞外物質抑制產腸毒素大腸桿菌K88的生長定植。2羅伊氏菌素羅伊氏乳桿菌不僅具備乳酸菌主要的有益功效,而且還具備產生廣譜抗菌物質的特效。羅伊氏乳桿菌能合成并分泌羅伊氏菌素,是一種為非蛋白質類廣譜抗菌物質,可有效抑制有害菌的生長。羅伊氏菌素作為抗菌物質的優(yōu)越性已引起人們越來越多的關注,也因其獨特的生化特性及對人和動物安全無毒而具有十分廣闊的應用前景。2.1羅伊氏菌素的分離純化及其抗菌保鮮羅伊氏菌素,又稱3-羥基丙醛(3-HPA),是甘油兩步代謝的中間代謝產物。其代謝路徑如圖1所示,首先甘油在輔酶維生素B12和甘油脫水酶的作用下脫水產生3-羥基丙醛,并進一步通過輔酶NAD+和氧化還原酶作用還原成1,3-丙二醇。而在水溶液系統(tǒng)中,3-羥基丙醛的聚合和水合作用是可逆的,也就構成了3-羥基丙醛的動態(tài)系統(tǒng)。研究人員已分離并純化出羅伊氏菌素,并通過核磁共振、質譜及紅外分析等方法,確認羅伊氏菌素是一個以3-羥基丙醛單體為轉換中心的復雜的動態(tài)混合體系,其成分包括3-羥基丙醛、3-羥基丙醛水合物及3-羥基丙醛的二聚體。在另一些細菌中也同樣發(fā)現(xiàn)了此代謝路徑,如克雷伯氏桿菌,但在這些細菌中,3-羥基丙醛只能作為一種短暫的代謝產物出現(xiàn)并很快被還原成1,3-丙二醇。而羅伊氏乳桿菌能合成超過自身需要量很多倍的3-羥基丙醛,并使之在體內得到大量穩(wěn)定地積累。表明羅伊氏乳桿菌對其自身產生的羅伊氏菌素具有很強的耐受性,且為所有產生3-羥基丙醛的細菌中耐受力最強的。因此,高產羅伊氏菌素的羅伊氏乳桿菌具有很大的工業(yè)應用潛力。2.2羅伊氏菌素可降低溫度大多數乳酸菌所產生的細菌素或類細菌素只有很窄的抗菌譜,只能抑制與產生菌種屬相近的一些細菌。而羅伊氏菌素是一種廣譜有效的抗菌物質,能抑制埃希氏菌、沙門氏菌、志賀氏菌、李斯特菌、弧菌、梭菌、葡萄球菌的生長。研究表明,羅伊氏菌素濃度在15~30μg/ml,可抑制革蘭氏陽性菌和陰性菌、酵母、真菌及原生動物的生長,當濃度超過該范圍4~5倍時,可殺死包括羅伊氏乳桿菌本身的乳酸菌。EI-Ziney和Debevere的研究發(fā)現(xiàn),羅伊氏菌素可有效降低超高溫瞬時滅菌(UHT)牛奶、松軟奶酪及肉制品中單核細胞增生李斯特菌和大腸桿菌O175:H7的數量。Dobrogosz等將羅伊氏菌素添加到已感染細菌病毒(分別為大腸桿菌噬菌體λ和噬菌體8014-B2)的大腸桿菌或植物乳桿菌細胞中,結果發(fā)現(xiàn)羅伊氏菌素對病毒的復制同樣具有有效的抑制作用。此外,大多數細菌素為多肽或蛋白質類物質,它們的抗菌特性通常受到蛋白酶的破壞,而羅伊氏菌素是由小分子水溶性中性物質組成的混合物,因而它的抑菌活性不會被蛋白酶破壞,具有更強的穩(wěn)定性。2.3其他特殊的食品添加劑我國衛(wèi)生部于2003年批準了羅伊氏乳桿菌可作為保健食品益生菌種。該菌合成和分泌的羅伊氏菌素具廣譜抗菌特性,且對人和動物無害,在生物抑菌劑、抗感染治療劑、生物交聯(lián)劑、新型生物材料的前體等方面有著廣泛的潛在用途。既可應用于食品、飼料、飲料等的防腐以提高產品貨架期,又可作為生物抑菌劑,用于不能高溫滅菌的食品牛奶、生物材料的滅菌;作為嬰兒食品添加劑,用于調節(jié)嬰兒腸道菌群分布;作為口香糖添加劑,用于殺死口腔病原菌以預防齲齒;作為抗感染治療劑,替代抗生素用于動物病原蟲引發(fā)疾病的治療。此外,3-羥基丙醛還可以作為消毒劑和生物組織的固定劑,對生物體的毒害更小。3羅伊氏乳桿菌對小鼠隱頭孢蟲感染的影響益生菌對人和動物均顯示出有效的益生功效,但其益生功效的具體機制尚未完全清楚。這些益生功效包括增強機體先天性和獲得性免疫,刺激機體免疫器官的成熟,激活免疫系統(tǒng),增加抗炎細胞因子的產生,降低腸道的滲透性等。Liu等最近研究發(fā)現(xiàn),多種人源羅伊氏乳桿菌,包括DSM17938、ATCCPTA4659、ATCCPTA5289和ATCCPTA6475等均可通過單核吞噬細胞系統(tǒng)來刺激免疫調節(jié)反應,進而不同程度地減輕人類腸道炎癥。Alak等用因腹腔接種LP-BM5白血病毒而患免疫缺陷癥的C57BL小鼠作為實驗對象,來檢測羅伊氏乳桿菌對小球隱孢子蟲的控制作用。接種LP-BM5病毒后,這些小鼠均會表現(xiàn)出淋巴結腫大,對小球隱孢子蟲易感的癥狀。而先飼喂羅伊氏乳桿菌(108cfu/d)10天后再用小球隱孢子蟲來感染小鼠,發(fā)現(xiàn)這些實驗鼠的腸道上皮細胞均未感染小球隱孢子蟲,而未飼喂羅伊氏乳桿菌的小鼠,在受小球隱孢子蟲感染后的糞便中發(fā)現(xiàn)了小球隱孢子蟲的卵母細胞。研究結果表明,羅伊氏乳桿菌有助于保護免疫缺陷的個體免受這種原生動物疾病的感染。另一些體內研究顯示CD4+T淋巴細胞和小鼠干擾素-γ在機體抵抗感染中起著至關重要的作用。在飼喂羅伊氏乳桿菌的雞回腸固有層中發(fā)現(xiàn)CD4+T淋巴細胞的數量與對照組相比顯著增加,表明飼喂羅伊氏乳桿菌可能是通過提高淋巴細胞數量來促使機體抵抗感染的。羅伊氏乳桿菌對T細胞受體-α缺陷的小鼠同樣具有保護作用。T細胞受體-α缺陷小鼠感染了小球隱孢子蟲后,小鼠盲腸會出現(xiàn)炎性損傷,這種盲腸損傷主要是由炎癥細胞滲入固有層致使大量上皮細胞增生所致。先將羅伊氏乳桿菌飼喂此種免疫缺陷型小鼠,再利用小球隱孢子蟲感染,發(fā)現(xiàn)飼喂了羅伊氏乳桿菌的小鼠回腸和盲腸中的小球隱孢子蟲數量明顯少于對照組,且上皮細胞增生及盲腸發(fā)炎的現(xiàn)象明顯好轉。該研究表明,羅伊氏乳桿菌對維持免疫缺陷小鼠腸道黏膜的完整性,以及提高動物免疫力具有明顯的促進作用。Anukum等利用羅伊氏乳桿菌和鼠李糖乳桿菌,觀察其對由尿道共生致病菌引起尿道感染的治愈效果。結果表明,乳桿菌可以通過下調患者神經性膀胱中的TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10和IL-12而使患者膀胱炎的癥狀得以減輕。4羅伊木藍草菌在人類和動物疾病中的相互作用4.1羅伊木藍對動物健康的影響研究4.1.1對腸道特異性羅伊氏乳桿菌的作用目前常用化學藥劑對實驗鼠進行腸炎誘導,常使用的化學藥劑有乙酸或甲氨蝶呤等。Fabia等建立了一個由乙酸誘導大鼠患上潰瘍性大腸炎的實驗動物模型。他們發(fā)現(xiàn),在進行乙酸飼喂后立即以5×107~7×107cfu的劑量飼喂大鼠腸道特異性羅伊氏乳桿菌,可阻止?jié)冃源竽c炎的炎癥發(fā)展。甲氨蝶呤(MTX)是一種應用于人類的抗腫瘤化學藥物,也可作為治療類風濕疾病的藥物。但該藥會引起細胞毒素對腸道黏膜的傷害,破壞胃腸道微生態(tài)平衡,引起嚴重的小腸結腸炎。向大鼠腹腔內注射MTX可引起嚴重的非穿孔性小腸結腸炎,同時伴隨體重驟減、黏膜組織物減少及腸道屏障損傷等癥狀。Mao等的實驗證明羅伊氏乳桿菌有助于建立腸道微生態(tài)平衡,降低由細菌轉移引起的腸道通透性損傷,即有助于削弱由MTX誘導產生的大鼠小腸結腸炎。他們還發(fā)現(xiàn)添加羅伊氏乳桿菌或植物乳桿菌會顯著增加回腸結腸分泌的IgA水平,同時提高CD4+和CD8+的數量。4.1.2羅伊氏乳桿菌的噴霧對agd的影響剛孵化的禽類常因感染細菌或受環(huán)境應激易造成生長抑制甚至死亡,此種現(xiàn)象稱作禽類生長抑制現(xiàn)象(AGD),已成為嚴重影響禽類養(yǎng)殖生產的病癥之一。Ivan等證明同樣是經低溫冷應激的幼雛,經羅伊氏乳桿菌液噴霧及飼喂羅伊氏乳桿菌(106cfu)處理的實驗組均表現(xiàn)出較對照組更少的死亡數和平均體重的顯著增加。另外,幼雛也常因飼料配方中蛋白質含量不足而引起生長抑制,飼料營養(yǎng)的不足是引起AGD另一主要原因。Dunham等的實驗中用含有羅伊氏乳桿菌的預防劑進行飼喂發(fā)現(xiàn)小雞的生長遲緩得到了非常顯著的改善。以上表明飼喂羅伊氏乳桿菌可顯著調節(jié)應激誘導的及營養(yǎng)不足誘導的生長抑制。4.1.3兩組大鼠腹瀉的發(fā)生率仔豬較易發(fā)生由小球隱孢子蟲引起的腹瀉。Dobrogosz等的實驗是將飼喂羅伊氏乳桿菌的仔豬組與不飼喂羅伊氏乳桿菌的對照組進行比較,記錄發(fā)生腹瀉的起始時間及腹瀉的嚴重程度。結果表明添加羅伊氏乳桿菌的處理組發(fā)生腹瀉的仔豬數量明顯減少,且發(fā)生腹瀉的嚴重程度也有明顯減輕。證明羅伊氏乳桿菌劑對由小球隱孢子蟲引起的仔豬腹瀉有明顯的調節(jié)改善功效。4.1.4對飼養(yǎng)羅伊氏乳桿菌生長和飼料利用的影響實驗室中的實驗已驗證了羅伊氏乳桿菌的諸多益生效用,在此基礎上更需要明確其在商業(yè)化養(yǎng)殖環(huán)境下是否具有類似功效。Casas等在16個火雞養(yǎng)殖場中進行了該項實驗,實驗涉及火雞總量為280000只。將每572只火雞隨機分成一組,在其孵化到生長42天的過程進行體重記錄。結果表明,飼喂羅伊氏乳桿菌的有益功效在飼喂開始后的幾天內就很快顯現(xiàn)出來。對照組火雞的平均體重為3.8lbs,而飼喂羅伊氏乳桿菌的處理組的平均體重為4.2lbs,處理組體重較對照組有9.5%的增長,即飼喂羅伊氏乳桿菌組表現(xiàn)出較對照組更好的生長勢頭。另外,分別對16個商業(yè)化養(yǎng)殖場各自的實驗數據進行統(tǒng)計表明,用孵化后4個月大上市年齡期的火雞作實驗對象的12個組的實驗效果更為明顯,即通過飼喂羅伊氏乳桿菌使各個生產指標,包括存活率、飼料轉化率、體重、A級質量的禽類數量等都得到顯著改善。證明無論在實驗室條件還是商業(yè)生產條件下,羅伊氏乳桿菌作為益生菌飼喂動物均可表現(xiàn)出一致的良好效用。4.1.5羅伊氏乳桿菌添加對豬生長和飼料利用的影響B(tài)lanchard等的相關實驗表明,用羅伊氏乳桿菌,以及添加優(yōu)質調味料的飼料分別飼喂斷奶前后仔豬,按照飼喂方式的不同分為三組:第一組(n=44)為對照組,不加高銅、抗生素及羅伊氏乳桿菌;第二組(n=41)按照商業(yè)飼料配方飼喂,其配方中添加了高銅和抗生素;第三組(n=53)用添加了羅伊氏乳桿菌的飼料進行飼喂,其添加劑量按每頭豬每天含108cfu羅伊氏乳桿菌計。測定仔豬斷奶前的出生重量和生長速率,以及測定斷奶后21天仔豬的生長速率和飼料轉化率。結果表明,在斷奶前的實驗中,羅伊氏乳桿菌添加處理組及抗生素添加處理組的各數據指標較對照組都未表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢;然而在斷奶后的實驗中,飼喂羅伊氏乳桿菌組的生長速率有了明顯的提高,同時該組的豬表現(xiàn)得更潔凈更健康。而綜合評價整體促生長功效,則羅伊氏乳桿菌處理組和抗生素處理組的效果趨于一致,且都優(yōu)于對照組。可見,飼喂羅伊氏乳桿菌對促進仔豬生長可與添加抗生素組達到一致水平,表明在某些動物養(yǎng)殖中添加羅伊氏乳桿菌的確可作為抗生素的替代品,而且是促進畜禽生長的一種可選的新型生物促生長方式,從而削弱由于抗生素使用所致不同物種間病原菌對抗生素的耐藥性。4.2羅伊氏乳桿菌的治療腹瀉是兒童最常見的病癥。在急性腹瀉期,原有的正常腸道菌群包括乳酸桿菌、雙歧桿菌、擬桿菌等,發(fā)生快速的改變。多項研究表明,乳酸桿菌的共生會加速宿主腸道微生物群恢復其原有的良好狀態(tài),從而調節(jié)急性腹瀉患者腸道內的菌群穩(wěn)態(tài)。Shomikova等用從人母乳中分離的羅伊氏乳桿菌進行實驗,實驗對象是6~36月齡的患有急性腹瀉的兒童;其中75%的患兒腹瀉是由輪狀病毒引起。實驗檢測了處理后水樣腹瀉的持續(xù)時間,羅伊氏乳桿菌組是1.7天,安慰劑組(Placebo)是2.9天;繼而統(tǒng)計了處理后第二天腹瀉未愈人數的比例,羅伊氏乳桿菌組為26%,安慰劑組為81%。從而證明羅伊氏乳桿菌對治療兒童輪狀病毒腹瀉有良好的治療效果。另外,Shornikova等的另一個實驗證明羅伊氏乳桿菌治療腹瀉的功