酵母雙雜交系統(tǒng)檢測蛋白質(zhì)的研究進展

酵母雙雜交系統(tǒng)檢測蛋白質(zhì)的研究進展

1989年，倫琴提出并建立了一種新的遺傳方法，以直接檢測母系細胞中的蛋白質(zhì)相互作用。這一技術(shù)在細胞周期與分化、細胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、癌基因產(chǎn)物功能、基因表達調(diào)控及蛋白自身特性等研究領(lǐng)域,受到越來越多的關(guān)注。隨著該技術(shù)的發(fā)展和研究的深入,衍生出酵母單雜交、三雜交、反向雙雜交等體系。其應(yīng)用范圍擴展至蛋白質(zhì)與蛋內(nèi)質(zhì)、蛋白質(zhì)與DNA、RNA及與其它小分子相互作用的研究,對新作用蛋白的發(fā)現(xiàn),蛋白間相互作用網(wǎng)絡(luò)的認識,甚至對整個蛋白質(zhì)組(proteome)的研究起到巨大推動作用。1經(jīng)典的雙重均混合系統(tǒng)1.1抑制劑序列的激活酵母雙雜交系統(tǒng)的建立基于對真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認識。參與這一過群的轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)上是組件式的(modular),往往由兩個(或兩個以上)相對獨立的結(jié)構(gòu)域組成,即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(bindingdomain,BD)和轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域(activitiondomain,AD)。兩結(jié)構(gòu)域建立空間聯(lián)系是轉(zhuǎn)錄激活的關(guān)鍵,而單獨作用無法激活轉(zhuǎn)錄過程。分別將擬研究的獵物(prey,或稱靶蛋白)蛋白的基因與編碼AD的序列結(jié)合,誘餌(bait)蛋白的基因與編碼BD的序列結(jié)合,形成兩段融合基因。當(dāng)兩段融合基因通過載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入同一酵母細胞表達時,分別生成融合蛋白prey-AD與bait-BD。借助誘餌蛋白與靶蛋白在核內(nèi)的相互作用,分離的AD與BD在空間上得以接近,形成完整的有活性的轉(zhuǎn)錄因子,進而與上游激活序列(upstreamactivatingsequence,UAS)結(jié)合,激活相應(yīng)報告基因(reportgene)獲錄。反過來,報告基因的表達與否,可判斷靶蛋白與誘餌蛋白之間是否相互作用。通過簡單的酵母遺傳分析,對報告基因進行檢測,即可實現(xiàn)對蛋白間相互作用的分析。1.2真核酵母模型(1)采用酵母作為報道株,菌株生長速度快,步驟簡潔,容易操作。(2)敏感度高。許多微弱或短暫的蛋白之間的相互作用,借助報告基因表達過程中多級放大效應(yīng)反映出來。(3)在真核酵母活細胞內(nèi)進行,蛋白易于保持天然折疊狀態(tài),更接近體內(nèi)真實水平。(4)酵母有許多營養(yǎng)缺陷標記,結(jié)果易于篩選。(5)應(yīng)用范圍比較廣泛。1.3基因治療中蛋白間相互作用的檢測(1)尋找與靶蛋白相互作用的蛋白,尤其是篩選cDNA文庫。(2)特異地檢測已知蛋白間相互作用。(3)確定蛋白相互作用的部位甚至關(guān)鍵氨基酸。(4)確定蛋白之間弱相互作用。(5)確定基因治療中多肽類藥物作用機制。(6)建立蛋白相互作用圖譜。2母乳喂養(yǎng)系統(tǒng)的不足和對策2.1蛋白質(zhì)作用系統(tǒng)融合蛋白必須轉(zhuǎn)至核內(nèi)才能活化轉(zhuǎn)錄,這是影響雙雜交系統(tǒng)進一步推廣的主要障礙。對于胞外受體-配體作用,以及需要核外加工修飾等翻譯后介導(dǎo)的蛋白質(zhì)作用而言,該系統(tǒng)應(yīng)用受到限制。一般而言,膜蛋白也不適于此,已出現(xiàn)通過改變某些細胞膜定位序列,在載體中添加核定位信號序列的方法以及專門研究非核內(nèi)蛋白作用的系統(tǒng)。2.2菌株的篩選和檢測指誘餌和靶蛋白在沒有發(fā)生作用的情況下,報告基因被激活。進行文庫篩選時,這是最常見的干擾實驗準確性的問題。(1)靶蛋白本身含轉(zhuǎn)錄活化成分(如可結(jié)合報告基因上游DNA),即prey-AD自身可激活報告基因轉(zhuǎn)錄。(2)誘餌蛋白本身有激活作用。對以上情況,可通過嚴格對照實驗,排除假陽性。對誘餌和靶蛋白分別作單獨活性報告,不失為一好方法。(3)prey-AD對bait-BD無特異性,與無關(guān)的DNA結(jié)合域雜交體共轉(zhuǎn)化酵母亦表現(xiàn)陽性。在篩出陽性克隆后,將Prey-AD與無關(guān)DNA結(jié)合域雜交體作共轉(zhuǎn)化酵母測試,以排除假陽性。Harper采取一種快速鑒別假陽性的方法:用選擇性培養(yǎng)基去除陽性克隆的bait-BD質(zhì)粒,只剩prey-AD質(zhì)粒,與不同性別的含無關(guān)DNA結(jié)合域雜交體的酵母交配,以二倍體酵母是否表現(xiàn)陽性來鑒別假陽性。省去了回收質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母的煩瑣步驟。(4)由于未被發(fā)現(xiàn)的調(diào)控途徑激活報告基因,這種假陽性需用其它實驗排除。(5)假陽性也可能是雙雜交設(shè)計的原因:cDNA庫的構(gòu)建中,如使用隨機引物,可能使蛋白中一些非暴露區(qū)域暴露,并被篩選出來;一對不在同一時間、同一種組織表達的蛋白可能發(fā)生作用,而不是生理意義上的作用。(6)某些蛋白是依賴于遍在蛋白的蛋白酶水解途徑成員,它們具有普遍蛋白間相互作用能力?？膳卸ㄏ嗷プ饔玫奶禺愋圆⒃龃蟮鞍仔畔⒘?有助于去除假陽性結(jié)果;將報告基因整和到染色體上,可使基因表達水平穩(wěn)定,消除因質(zhì)?？截悢?shù)變動對結(jié)果的影響。另外,可用免疫共沉淀的方法鑒定結(jié)果。2.3水資源的制備2個蛋白之間本應(yīng)發(fā)生相互作用,但報告基因不表達成表達程度低檢測不到。盡管非實驗中主要問題亦應(yīng)重視。常見原因:(1)融合蛋白對細胞有毒性。這時,應(yīng)選敏感性低的菌株或拷貝數(shù)低的載體,采取共轉(zhuǎn)化的方法也可以降低毒性。(2)對于蛋白間相互作用效弱,則應(yīng)選高敏感菌株或高考貝載體。2.4使用小體誘導(dǎo)蛋白如何提高轉(zhuǎn)化率是文庫篩選成敗的關(guān)鍵,尤其是低豐度cDNA文庫篩選,必須提高轉(zhuǎn)化率。(1)共轉(zhuǎn)化較依次轉(zhuǎn)化省時省力,并可減弱或消除融合表達蛋白對酵母毒性。(2)酵母兩性接合是更為有效的方法,將誘餌蛋白載體與靶蛋白載體分別轉(zhuǎn)入不同接合型單倍體酵母中再雜交,將誘餌蛋白與靶蛋白帶入同一二倍體細胞中。Fromont-Racine等人對這一技術(shù)作了進一步改進,用于蛋白質(zhì)組研究。以10種與mRNA前體剪接有關(guān)的蛋白作起始“誘餌”,從5×105個克隆的釀酒酵母基因組文庫中先后進行3輪15次篩選,最終從700個陽性克隆中得到剪切因子(新發(fā)現(xiàn)5種)及其他相關(guān)因于67種。(3)構(gòu)建文庫也非常重要,已出現(xiàn)采用體內(nèi)重組技術(shù)達到目的的方法。3關(guān)于母親飼料系統(tǒng)的進一步發(fā)展和展望3.1蛋白質(zhì)間相互作用的鑒定哺乳動物細胞作為宿主的雙雜交體系也在不斷改進和推廣,酵母細胞中不能完成的某些蛋白產(chǎn)物修飾過程得以彌補,使蛋白間作用更接近體內(nèi)實際情況。中國地鼠卵巢細胞(CHO)、非洲綠猴腎(COS)等細胞是較成熟的哺乳細胞宿主。除表型篩選外,測定放線菌酮乙酰轉(zhuǎn)移酶活性來鑒定蛋白間結(jié)合程度成為常規(guī)手段。因為此系統(tǒng)能更好地模擬細胞內(nèi)環(huán)境,因而利于探明蛋白相互作用的機制。3.2增加結(jié)合ndv的分子序列Wang和Rddd基于酵母雙雜交系統(tǒng)提出單雜交系統(tǒng),用于研究DNA-蛋白質(zhì)間相互作用。不同之處僅在于它省略了雙雜交系統(tǒng)中bait-BD蛋白雜交體,代之以具有蛋白重要結(jié)合位點的DNA?？衫肈NA序列捕獲具有與之特異結(jié)合的結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。該體系最適于研究參與基因轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的蛋白質(zhì)?？捎糜诖_定已知DNA-蛋白質(zhì)之間相互作用;獲取能與順式作用元件結(jié)合的反式作用因子;準確定位蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及結(jié)合的核酸序列。Wei等采用酵母單雜交體系確定了特異性結(jié)合于海膽胚胎孵化酶(SpHE)基因調(diào)控區(qū)域的反式作用因子SpEst4。酵母單雜交系統(tǒng)靈敏性高,可直接獲得與DNA特異結(jié)合的蛋白質(zhì)的基因序列。與雙雜交系統(tǒng)類似,也同樣會出現(xiàn)假陽性和假陰性的問題,有待進一步完善。3.3蛋白間相互作用三雜交系統(tǒng)是SenGupta等發(fā)展起來的,與雙雜交系統(tǒng)原理相似,只是兩雜交蛋白結(jié)合需通過第3個分子介導(dǎo)。三雜交系統(tǒng)必須滿足:兩蛋白無直接作用,必須通過第3個成分才能激活轉(zhuǎn)錄;第3個分子具有結(jié)合兩蛋白的位點。許多細胞內(nèi)信號傳遞過程中,兩蛋白間相互作用涉及第3個分子?；诖?三雜交系統(tǒng)用于研究蛋白與RNA、與多肽及其它小分子間的作用,大大擴展了酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用范圍。Zhang等利用三雜交系統(tǒng)首先研究了表皮生長因子(EGF)受體、Grb2和鳥嘌呤核酸交換蛋白(SOS)3種蛋白間相互作用。Bacharach用此系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)HIV1Gag蛋白可特異性與衣殼信號的含4個莖環(huán)結(jié)構(gòu)的139個核苷酸的RNA結(jié)合。酵母三雜交系統(tǒng)較雙雜交系統(tǒng)應(yīng)用更廣,但對于不易穿膜難于進入酵母細胞的分子不適用,同樣不適合膜蛋白的研究。3.4基于蛋白間相互作用酵母雙雜交系統(tǒng)創(chuàng)立的初衷是研究蛋白間相互作用,如果這種作用很重要,那么解離這種作用必然導(dǎo)致對生物的重大影響,而研究阻斷蛋白間相互作用的因素也就很重要。如研究如何阻斷癌基因產(chǎn)物與宿主蛋白間相互作用,以及癌細胞間信息傳遞。逆向雙雜交系統(tǒng)由Shih等創(chuàng)立,可作為酵母雙雜交系統(tǒng)較好的補充。與酵母雙雜交系統(tǒng)比較,突出的特點在于構(gòu)建一種反向篩選報告基因,即蛋白間特異相互作用所激活的報告基因能阻礙轉(zhuǎn)化體(宿主菌)的生長,從而發(fā)現(xiàn)蛋白間結(jié)合的解離因素。Shih等用該系統(tǒng)對阻斷環(huán)腺苷酸(cAMP)效應(yīng)分于結(jié)合蛋白與輔助因子相互作用的誘變劑進行了研究。Vidal等據(jù)此發(fā)現(xiàn)了影響轉(zhuǎn)錄因子E2F1中與DP1相互作用的點突變。另外,還有雙誘餌系統(tǒng),而分離的泛素系統(tǒng)、蛋白片段互補分析、阻遏物重構(gòu)分析及研究膜蛋白的SOS恢復(fù)系統(tǒng)等非轉(zhuǎn)錄篩選系統(tǒng),是利用蛋白質(zhì)的其它結(jié)構(gòu)特點來建立的全新系統(tǒng),不依賴轉(zhuǎn)錄因子活性