玉米b-1926的應(yīng)用研究

玉米b-1926的應(yīng)用研究

bt-176是一家開發(fā)的抗蟲、耐草、耐寒的混合玉米品種。美國農(nóng)業(yè)部(USDA)1994年受理該公司的申請(qǐng),并于1995年批準(zhǔn)在美國國內(nèi)無限制種植。隨后,日本(1996)、加拿大(1996)、阿根廷及歐盟各成員國(1997)也先后準(zhǔn)許無限制種植,Bt-176玉米的種植面積不斷擴(kuò)大。同時(shí),美國(1995)、加拿大(1995)、日本(1996)及英國、丹麥、荷蘭、瑞士和阿根廷等國分別批準(zhǔn)Bt-176玉米作為食物或飼料來源并可上市銷售。與此同時(shí),Bt-176玉米食用安全問題也受到日益關(guān)注,尤其是導(dǎo)入抗性基因及其表達(dá)蛋白對(duì)人類健康有目的或非目的影響和營養(yǎng)價(jià)值改變等問題為各國政府、研究機(jī)構(gòu)及普通消費(fèi)者關(guān)注的焦點(diǎn)。近年來,有關(guān)Bt-176玉米食用安全性評(píng)價(jià)的研究報(bào)道不斷出現(xiàn),美國FDA、加拿大衛(wèi)生部,澳大利亞—新西蘭食品管理局(ANZFA)以及歐盟管理部門等也進(jìn)行了一系列的安全評(píng)價(jià)。本文旨在介紹這方面的主要研究結(jié)果和最新進(jìn)展,以期為其他轉(zhuǎn)基因植物食用安全性研究提供參考價(jià)值。1bt-17玉米在草銨膦玉米中的表達(dá)轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米Bt-176是利用基因工程技術(shù)分別將蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)亞種kurstaki的Cry1A(b)基因、土壤細(xì)菌Streptomyceshygroscopicus的bar基因等外源基因?qū)胗衩字卸@得的抗玉米螟(Ostrinianubilalis,ECB)和耐草銨膦(phosphinothricin)轉(zhuǎn)基因品種。Cry1A(b)基因表達(dá)產(chǎn)生特異性殺蟲晶體蛋白(insecticidalcrystalproteinICP)在特定pH條件下激活,通過與昆蟲中腸上皮細(xì)胞受體特異結(jié)合,導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔,同時(shí)也可產(chǎn)生毒性協(xié)同作用,使整個(gè)細(xì)胞失去平衡,最終導(dǎo)致昆蟲死亡。bar基因主要作為選擇性標(biāo)記物,可產(chǎn)生PAT酶(phosphino-thricinacetyltransferase),提高抗除草劑草銨膦的能力。Bt-176玉米還導(dǎo)入了bla基因,其主要是作為在DNA克隆和重組階段選擇轉(zhuǎn)換細(xì)菌的標(biāo)記物,產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶(β-lactamase)可提高抗抗生素氨芐青霉素(ampicillin)的能力。Privalle等(1994)采用ELISA方法測(cè)定了Bt-176玉米不同生長期及不同器官Cry1A(b)蛋白的含量(表1)。結(jié)果表明,Cry1A(b)蛋白主要存在于葉片和花粉中,其他組織如籽實(shí)、根和莖中含有微量毒蛋白,但均低于最小檢出量。整株測(cè)定結(jié)果表明,Cry1A(b)蛋白含量(干重比)在幼苗期最高,隨著生長期延續(xù),含量逐漸降低。通過分析Cry1A(b)蛋白占植物總蛋白比例發(fā)現(xiàn),Bt-176玉米在開花期Cry1A(b)蛋白平均量最高,為14.4μg/g蛋白(即占總蛋白含量的0.00144%)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Bt-176玉米對(duì)草銨膦產(chǎn)生一定的抗性。ELISA法測(cè)定結(jié)果表明(表1),Bt-176玉米葉片、根、木髓和整株含有微量的PAT,但含量低于最小檢出量,籽實(shí)和花粉中未檢出PAT。Bt-176玉米中PAT含量不及先正達(dá)公司開發(fā)的專門抗草銨膦玉米品種的1/30。因此,可以認(rèn)定Bt-176玉米不能作為抗草銨膦玉米品種使用。另外,導(dǎo)入的bla基因僅僅作為啟動(dòng)子,一般不會(huì)在植物組織中表達(dá)。通過β-內(nèi)酰胺酶活性測(cè)定及Northern印跡法測(cè)定結(jié)果表明,在Bt-176玉米葉片和花粉的蛋白浸提液中未測(cè)得酶活性,也未檢測(cè)出blamRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,表明bla基因在Bt-176玉米沒有表達(dá)。2中毒的研究2.1產(chǎn)品毒性分析2.1.1對(duì)克氏原螯蝦的急性毒性試驗(yàn)蘇云金芽孢桿菌(Bt)δ-內(nèi)源毒素(即晶體蛋白)作為殺蟲劑,自1938年在法國登記商品化生產(chǎn)以來,目前已成為世界上用途最廣、產(chǎn)量最大微生物殺蟲劑。目前已鑒定了82個(gè)亞種,并命名了184個(gè)亞類的基因,Cry1A(b)蛋白為其中一類。迄今為止尚無蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)源毒素對(duì)人體健康產(chǎn)生毒害作用的報(bào)道。由于目前已知的蛋白毒素均是產(chǎn)生急性毒性作用,因此Cry1A(b)蛋白毒理學(xué)研究主要局限于急性毒性試驗(yàn)。Cry1A(b)蛋白對(duì)鱗翅目昆蟲具有特異活性作用,而對(duì)非靶標(biāo)昆蟲、鳥類、魚類及哺乳動(dòng)物不起作用。大鼠活體經(jīng)口試驗(yàn)以及大鼠、小鼠、恒猴和人體體外試驗(yàn)表明,供試物沒有Cry1A(b)蛋白結(jié)合作用部位(Notebornetal.1995)。J.O.Khun(1994)對(duì)蘇云金芽孢桿菌kurstaki亞種HD1-9的內(nèi)源Cry1A(b)蛋白及Bt-176玉米Cry1A(b)蛋白分別進(jìn)行了小鼠急性經(jīng)口試驗(yàn)。內(nèi)源Cry1A(b)蛋白染毒劑量為5050mg/kg體重(Cry1A(b)蛋白含量占70%),Bt-176玉米葉片蛋白浸提液Cry1A(b)蛋白染毒劑量5050mg葉片蛋白/kg體重(Cry1A(b)蛋白含量為0.07%),即Cry1A(b)蛋白劑量為3.54mg/kg體重。每組試驗(yàn)雌雄小鼠各5只。試驗(yàn)結(jié)果表明,內(nèi)源Cry1A(b)蛋白處理組在14天試驗(yàn)期內(nèi)動(dòng)物未死亡,但染毒后第1天出現(xiàn)被毛蓬松等中毒癥狀,染毒1周后1只雌鼠體重降低,其他動(dòng)物未見異常,動(dòng)物剖檢亦無異常,因此內(nèi)源Cry1A(b)蛋白急性經(jīng)口LD50大于3535mg/kg體重。葉片蛋白浸提液Cry1A(b)蛋白染毒處理組在14天試驗(yàn)期內(nèi),2只動(dòng)物因灌胃操作失誤死亡,其余處理動(dòng)物未見死亡,但出現(xiàn)臨床中毒癥狀,主要表現(xiàn)為被毛蓬松、流淚、多尿、上瞼下垂和少動(dòng)等。除被毛蓬松癥狀外,4天后均恢復(fù)正常。動(dòng)物剖檢未見異常。在葉片蛋白浸提液對(duì)照組中,處理5天后出現(xiàn)被毛蓬松和少動(dòng)等癥狀,2只雌鼠體重略有下降,動(dòng)物剖檢未見異常。因此認(rèn)為Bt-176玉米葉片蛋白急性經(jīng)口LD50大于5050mg葉片蛋白/kg體重,即Cry1A(b)蛋白LD50大于3.54mg/kg體重。2.1.2急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)鑒于PAT的特點(diǎn),1997年美國EPA準(zhǔn)予在PAT及其產(chǎn)物登記時(shí)不制訂最大容許殘留水平。由于Bt-176玉米表達(dá)的PAT蛋白含量很低,組織提取量無法達(dá)到有關(guān)試驗(yàn)的含量要求,一般多從E.coli中提取表達(dá)的PAT蛋白進(jìn)行試驗(yàn)。Merriman(1996)對(duì)PAT蛋白進(jìn)行了小鼠14d急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)51%PAT蛋白的羧甲基纖維素溶液和加熱處理的52%PAT蛋白的羧甲基纖維素溶液兩個(gè)處理,同時(shí)以羧甲基纖維素溶液為溶劑對(duì)照。劑量為5050mg總蛋白/kg體重,折純劑量為2575mgPAT蛋白/kg體重。試驗(yàn)期間1只雄鼠因樣品中固形物顆粒堵塞食管死亡。溶劑對(duì)照組1只雄鼠出現(xiàn)輕微被毛蓬松癥狀。其他動(dòng)物未見異常,動(dòng)物剖檢亦無異常,PAT蛋白急性經(jīng)口LD50大于2573mg/kg體重。2.2bt-17玉米蛋白與b.n-端氨基酸序列及營養(yǎng)評(píng)價(jià)致敏性是食品安全性評(píng)價(jià)中重要內(nèi)容之一。盡管目前還沒有成熟的方法測(cè)定蛋白質(zhì)的潛在致敏性,但大多數(shù)過敏原具有共同特征,即多為糖基化蛋白,分子量10～70kD,加熱穩(wěn)定,以及胃蛋白酶、胰蛋白酶作用及酸性環(huán)境中不易分解等特征。因此通過氨基酸序列分析和特征分析,比較待測(cè)蛋白與已知過敏原相似性是確定其潛在致敏性有效手段。蘇云金芽孢桿菌是廣泛分布的土壤微生物,普遍存在于作物周圍。晶體蛋白作為廣泛使用的殺蟲劑,尚無人體過敏的報(bào)道。Bt-176玉米表達(dá)的Cry1A(b)蛋白分子量為65kD,N-端氨基酸序列與晶體蛋白一致,具有同源性,糖基化和乙酰作用化測(cè)定亦為陰性。試驗(yàn)結(jié)果表明(Notebornetal1995,Sandersetal1998),Bt-176玉米表達(dá)的Cry1A(b)蛋白在體外腸道模擬中可迅速降解,處理5～10min后已檢測(cè)不出Cry1A(b)蛋白。通過序列分析的比較表明,Cry1A(b)蛋白與已知過敏原沒有生物學(xué)意義上的相同性。bar基因源自Streptomyceshygroscopicus,動(dòng)、植物體內(nèi)本身不含有bar基因表達(dá)的PAT蛋白,因此在食品中不含有PAT蛋白。但Streptomyceshygroscopicus也是廣泛分布的土壤微生物,普遍存在于作物周圍,不排除PAT蛋白混雜在食物的可能性。體外試驗(yàn)表明,在模擬腸道液體(simulatedgastricfluid,SGF)中,PAT蛋白(3.2mg/ml胃液素)迅速降解,半衰期在1～2min之間。PAT蛋白為熱敏性蛋白,在37℃下培養(yǎng)10min,其活性即降低44%。通過與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知過敏原氨基酸序列比較,沒有發(fā)現(xiàn)PAT蛋白與已知過敏原和毒素生物學(xué)意義上的一致性。因此,通過上述分析,表明PAT蛋白在哺乳動(dòng)物腸道中溫度、pH值和肽酶作用下,被迅速破壞分解,不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生致敏作用。3收養(yǎng)特征3.1各變量之間的差異組分分析(proximateanalysis)試驗(yàn)結(jié)果表明,Bt-176玉米與同源對(duì)照玉米相比,籽實(shí)主要成分沒有明顯的差異(表2)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)不同品種之間在個(gè)別指標(biāo)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異,但這種差異性變化沒有規(guī)律性,而且變化均在文獻(xiàn)資料范圍之內(nèi),因此這些差異與基因?qū)霙]有必然聯(lián)系。通過測(cè)定玉米籽實(shí)16種氨基酸含量發(fā)現(xiàn),除脯氨酸和甘氨酸顯著增加(P>0.05)外,Bt-176玉米與同源對(duì)照玉米相比,沒有明顯變化。而且變化均在文獻(xiàn)資料范圍之內(nèi)。研究結(jié)果還表明,Bt-176玉米籽實(shí)5種脂肪酸(棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸及亞麻酸)和類胡蘿卜素(葉黃素、β-胡蘿卜素)含量沒有明顯差異性的變化,測(cè)定值均在文獻(xiàn)報(bào)道的范圍之內(nèi)。3.2玉米籽實(shí)及其類物抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)通常是指可抑制或阻礙代謝尤其是消化過程中重要途徑的物質(zhì),食物中含有一定抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)可降低營養(yǎng)物質(zhì)的利用率和營養(yǎng)價(jià)值(Watzl等,1995)。一般認(rèn)為玉米籽實(shí)含有一定的植酸鹽及胰島素和胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)抑制物等抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)(Wright,1987)?；蛐蛄蟹治鲅芯拷Y(jié)果表明,導(dǎo)入Bt-176玉米的基因片段中已剔除表達(dá)胰凝乳蛋白酶抑制物的基因位點(diǎn),同時(shí)酶活性測(cè)定結(jié)果也表明,Bt-176玉米組織內(nèi)源蛋白酶抑制物活性與對(duì)照沒有差異,說明Bt-176玉米組織胰凝乳蛋白酶抑制活性沒有變化。4抗蟲玉米bt-17b通過對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因玉米品種Bt-176基因轉(zhuǎn)化特征、毒理學(xué)和營養(yǎng)學(xué)的分析和評(píng)價(jià),可以得到如下結(jié)論:Bt-176玉米是通過導(dǎo)入蘇云金芽孢桿菌kurstaki亞種的Cry1A(b)基因和土壤細(xì)菌Streptomyceshygroscopicus的bar基因而獲得的抗蟲抗草銨膦的的玉米品種,對(duì)鱗翅目害蟲如歐洲玉米螟(EuropeanCornBorer,ECB)具有特定毒性。但不具有抗草銨膦的能力。檢測(cè)結(jié)果表明,Cry1A(b)蛋白主要分布于葉片和花粉,在玉米籽實(shí)中含量低于5ng/g鮮重。PAT蛋白沒有檢測(cè)到,blagene在玉米中沒有表達(dá)。玉米一般不含天然毒素或過敏原,是人類長期食用的安全食品。蘇云金芽孢桿菌的晶體蛋白作為殺蟲劑已長期使用,證明也是安全的。小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)表明,Cry1A(b)染毒劑量大于3535mg/kg,PAT染毒劑量大于2575mg/kg時(shí),均未見中毒癥狀。