青蒿琥酯對hela、siha細(xì)胞放射增敏作用的研究

青蒿琥酯對hela、siha細(xì)胞放射增敏作用的研究

近年來，國內(nèi)外科學(xué)家對中藥的治療做出了深入的研究和開發(fā)。1973年，中國科學(xué)家從中藥科黃科植物中分離出具有活性的單胞菌黃酮素。青蒿琥酯（Artesunate,Art）是青蒿素的眾多衍生物之一，分子式為C19H28O8，呈無色結(jié)晶或白色結(jié)晶性粉末，無臭，幾乎無味。研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素類藥物作為抗腫瘤藥，其對肝癌、胰腺癌、肺癌等具有明顯的抑制作用。同時鑒于青蒿素及其衍生物內(nèi)的過氧化橋分子結(jié)構(gòu)及其眾多藥理作用，近來對其放射增敏作用機(jī)理進(jìn)行了充分研究。但是青蒿琥酯作為放射增敏藥物，對人宮頸癌細(xì)胞作用3研究還未見報道。本實驗將通過細(xì)胞輻射損傷實驗，分析研究青蒿琥酯對人宮頸癌細(xì)胞的輻射增敏作用。1實驗材料和方法1.1青蒿背景酯、胞松素b、cyt-b染色劑MTT購于上海生工公司；秋水仙素（Colchicine）、胞松素B(CytochatasinB,Cyt-B）、青蒿琥酯、Giemsa染色劑均購于美國Sigma公司；顯微鏡為日本Olympus公司BX51型。1.2實驗方法1.2.1上海細(xì)胞庫人宮頸癌HeLa、Siha細(xì)胞株，購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。接種細(xì)胞在含10%小牛血清DMEM培養(yǎng)基細(xì)胞瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，單層貼壁生長。1.2.2吸收劑量測定室溫條件，60Coγ射線，劑量率0.57Gy/min，各組吸收劑量分別為0、2、4和6Gy。試驗在蘇州大學(xué)放射醫(yī)學(xué)與公共衛(wèi)生學(xué)院輻照中心進(jìn)行。1.2.3藥物的制備青蒿琥酯粉末由5%NaHCO3溶解為5g/L的儲備液，-20℃保存?zhèn)溆?，實驗前用DMEM培養(yǎng)液將其稀釋至實驗所需濃度。1.2.4青蒿違全酶活性檢測青蒿底物a值將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用0.25%胰酶消化，細(xì)胞計數(shù)后，培養(yǎng)液稀釋至濃度為4×104/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔100μL，培養(yǎng)24h后，加入配制的青蒿琥酯溶液使終濃度分別為0、1、2、4、8、10、20和40μg/mL，各濃度點設(shè)置5個平行樣。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，換培養(yǎng)基，每孔加入5mg/mLMTT20μL，孵育4h，棄上清，每孔加入DMSO100μL，振動5min后，酶標(biāo)儀（背景波長570nm、參考波長630nm）測吸光度（A）值。計算細(xì)胞抑制率：細(xì)胞抑制率（%）=（1-各藥物濃度組平均A值/對照組平均A值）×100%。1.2.5體外細(xì)胞后細(xì)胞的制備取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以3×105/mL濃度接種于60mm培養(yǎng)皿中，每皿均為2mL細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁后，藥物處理組加入青蒿琥酯溶液，每組均準(zhǔn)備四個劑量點樣，每個劑量點準(zhǔn)備3個樣，培養(yǎng)24h后進(jìn)行照射。照后細(xì)胞立即更換培養(yǎng)基并加入0.001%秋水仙素20μL，繼續(xù)培養(yǎng)10h。用0.25%胰酶消化并收獲細(xì)胞移入試管中，經(jīng)2000r/min離心10min，棄上層培養(yǎng)基，加入2mL37℃預(yù)溫的0.075mol/LKCl低滲、新鮮固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）固定處理、冰玻片常規(guī)滴片、Giemsa染色，制成染色體片。顯微鏡下選擇染色體分散度良好的中期分裂相300個細(xì)胞，計數(shù)染色體型畸變：雙著絲粒體（dic）+著絲粒環(huán)（r）、染色體斷片。1.2.6顯微染色，觀察組微核片的制備照射前及照射中處理與常規(guī)染色體畸變法相同，照后細(xì)胞立即更換培養(yǎng)基并加入Cyt-B（終濃度為4mg/L），繼續(xù)培養(yǎng)24h。用0.25%胰蛋白酶消化并收獲細(xì)胞移入試管中，經(jīng)1,000r/min離心10min，棄上層培養(yǎng)基，加入2mL37℃預(yù)溫的0.075mol/LKCl低滲處理，新鮮固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）固定處理、常規(guī)滴片、Giemsa染色，制備完整細(xì)胞微核片。顯微鏡下計數(shù)。計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)(1)雙核細(xì)胞：胞體較大，胞核為2個，此系經(jīng)過一次分裂并被Cyt-B阻滯所致。染色質(zhì)較細(xì)致、疏松，核仁多清晰可見，胞漿豐富。(2)微核鑒別標(biāo)準(zhǔn)：微核必須位于雙核細(xì)胞質(zhì)中，與主核完全分開，如有重疊或相切，必須看到各自完整的核膜；微核呈圓形或橢圓形，直徑小于主核的1/3；無折光性；著色與主核相同或略淺。(3)分析細(xì)胞：油鏡下（10×100）計數(shù)，其中所含微核的細(xì)胞比率、微核的比率分別為微核細(xì)胞率（MNCF）、微核率（MNF），以千分率（‰）表示。1.3染色體畸變試驗實驗結(jié)果采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，對照組與處理組間比較采用t檢驗，各劑量組間差異采用One-wayANOVA分析，染色體畸變率、MNCF、MNF與劑量間的關(guān)系采用直線回歸與相關(guān)分析。p<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果和分析2.1青蒿表現(xiàn)對hela、siha細(xì)胞的輻射損傷作用從表1中可見，青蒿琥酯作用于HeLa及Siha細(xì)胞24h后，其對細(xì)胞的抑制率隨藥物濃度的增加而增加（p<0.01）。在藥物濃度分別為2μg/mL、4μg/mL時，青蒿琥酯對HeLa、Siha細(xì)胞的抑制作用較小，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05），故為減小藥物對細(xì)胞的毒性作用及最大程度的增加藥物的放射增敏效果，并使以下試驗中藥物對兩種細(xì)胞株的影響大致相同，確定HeLa、Siha細(xì)胞的輻射損傷試驗將分別采用藥物濃度2μg/mL、4μg/mL。2.2輻照對hela細(xì)胞回歸方程的影響HeLa、Siha細(xì)胞經(jīng)60Coγ射線單純照射組、藥物處理聯(lián)合輻照組，雙著絲粒體（dic）+著絲粒環(huán)（r）、染色體斷片結(jié)果見表2和表3，并發(fā)現(xiàn)HeLa、Siha細(xì)胞中染色體數(shù)目均為為非整倍體。從表2和表3中可見，同組HeLa或Siha細(xì)胞中的dic+r及染色體斷片率均隨著受照劑量的增加而增大。HeLa細(xì)胞在2、4和6Gy劑量下，與相同劑量輻照的單純照射組dic+r及染色體斷片率均低于藥物處理組（p<0.05），而Siha細(xì)胞藥物處理組與單純照射組的dic+r及染色體斷片率均無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（p>0.05）。在未予輻照的情況下，加藥處理組與單純照射組結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05）。從表2和表3數(shù)據(jù)相關(guān)分析表明，HeLa或Siha細(xì)胞單純照射組和藥物處理組的dic+r及染色體斷片率均與輻照劑量成正相關(guān)。應(yīng)用SPSS軟件回歸分析擬合二次回歸方程：HeLa細(xì)胞二次回歸方程單純照射組dic+r率：藥物處理組dic+r率：單純照射組染色體斷片率：藥物處理組染色體斷片率：Siha細(xì)胞二次回歸方程藥物處理組dic+r率：單純照射組染色體斷片率：藥物處理組染色體斷片率：式中，Y為染色體畸變率（%），D為受照劑量（Gy）。從以上回歸方程可看出dic+r率的線性方程為直線平方方程，而染色體斷片率為直線方程，擬合度均良好，回歸系數(shù)有高度的統(tǒng)計意義（p<0.01）。2.3輻照對mnpf和mnf的影響HeLa、Siha細(xì)胞經(jīng)60Coγ射線輻照單純照射組、藥物處理組微核細(xì)胞率、微核率計數(shù)結(jié)果見表4和表5。從表4和表5中可見，HeLa或Siha細(xì)胞的MNCF與MNF均隨照射劑量增加而增加（p<0.01）。HeLa細(xì)胞在2、4和6Gy劑量下，與相同劑量輻照的單純照射組與藥物處理組的MNCF存在明顯差別，具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05），另一指標(biāo)MNF的差別亦有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；而Siha細(xì)胞藥物處理組與單純照射組的MNCF或MNF均無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（p>0.05）。HeLa或Siha細(xì)胞在未予輻照的情況下，加藥處理組與單純照射組結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05）。從表4和表5數(shù)據(jù)相關(guān)分析表明，HeLa或Siha細(xì)胞單純照射組和藥物處理組的MNCF與MNF均與輻照劑量成正相關(guān)。應(yīng)用SPSS軟件回歸分析擬合二次回歸方程：HeLa細(xì)胞二次回歸方程單純照射組微核細(xì)胞率：藥物處理組微核細(xì)胞率：單純照射組微核率：藥物處理組微核率：Siha細(xì)胞二次回歸方程單純照射組微核細(xì)胞率：藥物處理組微核細(xì)胞率：單純照射組微核率：藥物處理組微核率：式中，Y為微核率或微核細(xì)胞率(‰)，D為照射劑量(Gy)。線性方程擬合度均良好，回歸系數(shù)有高度的統(tǒng)計意義（p<0.01）。3青蒿素輻射增敏機(jī)制我們在選擇了對實驗細(xì)胞毒性較小的藥物濃度這個前提下，實驗結(jié)果顯示：相同輻照劑量下，Hela細(xì)胞經(jīng)青蒿琥酯聯(lián)合輻照處理后，染色體雙著絲粒體+環(huán)、染色體斷片率、微核細(xì)胞率、微核率均較單純照射組明顯增高，而Siha細(xì)胞相應(yīng)的指標(biāo)并無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果表明，青蒿琥酯對Hela細(xì)胞具有放射增敏性，對Siha細(xì)胞無放射增敏性。對于青蒿素類藥物的放射增敏機(jī)制國內(nèi)外進(jìn)行了廣泛的研究，其機(jī)制較為復(fù)雜，有著眾多激酶參與，并與周期調(diào)控有關(guān)。文獻(xiàn)報道了二氫青蒿素的輻射增敏機(jī)制與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）表達(dá)降低及轉(zhuǎn)鐵蛋白量增加有關(guān)。我們課題組前期對青蒿素類藥物的輻射增敏機(jī)制進(jìn)行了深入探討，發(fā)現(xiàn)青蒿素能通過降低細(xì)胞周期蛋白wee1的表達(dá)量，增高cyclinB1的表達(dá)量，減弱p53突變基因細(xì)胞輻照后誘導(dǎo)的G2/M期阻滯效應(yīng)，使細(xì)胞的輻射損傷更為明顯，并且青蒿素能明顯提高輻照后細(xì)胞的微核率。細(xì)胞從G2期進(jìn)入M期的主要調(diào)節(jié)因素是Cdc2/CyclinB蛋白復(fù)合體。Cdc2一方面與CyclinB1相結(jié)合發(fā)揮功能；另一方面也受磷酸化影響被抑制活性。Thr-161磷酸化是Cdc2激酶活性所需的，而Thr-14和Tyr-15磷酸化則抑制Cdc2激酶活性。Weel則是控制Cdc2的Tyr-15磷酸化的主要激酶。Hela是p53基因突變細(xì)胞，其受到輻射損傷后只能通過G2期阻滯來進(jìn)