響應(yīng)面法優(yōu)化茶葉黃酮提取工藝及其抗氧化活性研究

響應(yīng)面法優(yōu)化茶葉黃酮提取工藝及其抗氧化活性研究

茶是科茶園的科植物。茶葉不僅具有提神清熱、消食化痰、解毒醒酒、降火止痢等藥理作用,現(xiàn)代研究表明茶葉還具有降血糖、降低膽固醇、抗衰老、抗菌、抗病毒、防癌等多種生理功能。綠茶中的多種黃酮類物質(zhì)具有特殊的生物效能,對人類健康有重要作用,它可以起到單重態(tài)氧清除劑的作用,并對過敏、感染、高血壓、腫瘤和AIDS等疾病具有輔助治療作用。黃酮物質(zhì)具有清除體內(nèi)自由基、防癌、預(yù)防心血管疾病等生物活性功能,常用于保健品和藥品,替代合成抗氧化劑;氧自由基是引起人體衰老、細(xì)胞損傷某些疾病發(fā)生的主要原因之一。目前常用的食品抗氧化劑(如BHT、BHA)大多是合成品,會引發(fā)食品安全性問題。天然抗氧化劑具有安全、無毒等優(yōu)點(diǎn)。本文利用廢棄的粗老綠茶研究了茶葉黃酮在聚乙二醇/鹽雙水相體系中的分配行為,通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法,探討了聚乙二醇和鹽的種類及用量,溫度、pH等對雙水相系統(tǒng)及茶葉黃酮萃取率的影響,優(yōu)化工藝條件;所得黃酮再研究其抗氧化活性,旨在為茶葉黃酮抗氧化功能的開發(fā)、利用以及食品的貯藏保鮮提供技術(shù)依據(jù)。1材料和設(shè)備1.1儀器、試劑和儀器茶葉采用溫州的粗老綠茶;2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、二苯基苦味酰基苯肼(DPPH·):美國Sigma公司;聚乙二醇(PEG)(不同分子量)及其他試劑購于國藥集團(tuán),均為分析純。紫外分光光度計(jì):北京普析通用儀器有限公司;KQ-300VDV型數(shù)控超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司;RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海亞龍生化儀器廠;Scientz-10N冷凍干燥機(jī):寧波新芝生物科技股份有限公司。1.2測試方法1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制1.2.2超聲提取法將茶葉洗凈、干燥、粉碎得茶葉末,稱取一定質(zhì)量的茶葉(1g),在超聲波功率280W,溫度50℃下浸提,乙醇體積分?jǐn)?shù)50%,料液比1∶20,超聲提取20min,直至浸提完全,將浸提液加入到1000mL的容量瓶中,定容,得浸提液。以50%乙醇為參照液于波長273nm處測其吸光度值得其質(zhì)量濃度0.0442mg/mL。1.2.3黃酮含量的測定在刻度具塞離心管中加入一定質(zhì)量的PEG、鹽、浸提液、蒸餾水,溶解,形成雙水相體系。所得體系PEG富集于上相,下相為水相。上相為亮黃色,大部分黃酮類物質(zhì)分布于此,下相為深黃色,多數(shù)雜質(zhì)和色素分布于此,分別測定上、下相體積,然后用紫外分光光度計(jì)于波長273nm處測其吸光度值,求得雙水相中茶葉黃酮的含量。R=Vt/Vb,K=Ct/Cb,Y=(1+1/RK)-1×100%式中:R為相比;Vt、Vb為上、下相體積(mL);K為茶葉中黃酮的分配系數(shù);Ct、Cb為上、下相茶葉中黃酮的質(zhì)量濃度(mg/mL);Y為得率(%)。1.2.4peg用量的測定在雙水相中,影響茶葉黃酮分配的因素有很多。量取1mL茶葉浸提液,以pH=9,在30℃水浴中提取20min為基準(zhǔn),分別考察PEG不同分子量及其不同量、組成雙水相不同鹽及其不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH、溫度及氯化鎂的添加量,以茶葉黃酮在雙水相的上相中的得率為指標(biāo),以確定影響較大的因素,每組試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值作圖。1.2.5響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取對茶葉黃酮在雙水相中分配行為影響較大的3個(gè)因素,采用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì),以茶葉黃酮在上相中的得率為響應(yīng)值,每組試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值,運(yùn)用SAS數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析,對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)因素和水平見表1。1.2.6dpph清除活性測定茶葉黃酮的還原能力:2.5mL不同濃度樣品與2.5mL0.2mol/L磷酸鈉緩沖液(pH6.6)和2.5mL1%鐵氰化鉀混合,50℃保溫20min,加入2.5mL10%三氯乙酸,混和物離心10min(3000r/min),上清液(5mL)加5mL去離子水,再加1mL0.1%三氯化鐵混合,靜止10min后在波長700nm處測吸光度。其吸光度的大小即反映了其還原能力的大小;用BHT和Vc作比較。茶葉黃酮對DPPH清除力的測定:DPPH分析法被廣泛用于清除自由基物質(zhì)性質(zhì)的研究。DPPH在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基,當(dāng)有清除劑存在時(shí),其孤電子被配對,吸光度下降或減弱。通過測定吸收減弱的程度,可評價(jià)自由基清除劑的活性。取一定濃度的樣品溶液2mL,加入2mL用乙醇配制的0.8mmol/mLDPPH溶液,用力振搖混勻后置暗室中靜置30min,于波長517nm處測定吸光度;用BHT和Vc作比較,計(jì)算DPPH清除率:DPPH清除率(%)=[1-(Ax-Ax0)/A0]×100式中Ax表示加入樣品溶液后的吸光度;Ax0表示樣品溶液本底的吸光度;A0表示空白對照液的吸光度。2結(jié)果與分析2.1單因素試驗(yàn)的結(jié)果和分析2.1.1黃酮分配實(shí)驗(yàn)結(jié)果取5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的Na2SO4和3g不同分子量的PEG分別組成雙水相體系作為研究體系,在pH為9,溫度為30℃的條件下,考察茶葉中黃酮的分配情況,見圖1。2.1.2不同質(zhì)量的peg600對黃酮類化合物的分配有影響2.1.3鹽和鹽的濃度對黃酮類化合物的分配有影響2.1.4ph值對分配系數(shù)k的影響取5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的Na2SO4和質(zhì)量為6g的PEG600組成雙水相體系,在溫度為30℃,pH值2～12之間,用鹽酸和NaOH調(diào)節(jié)pH值,考察不同pH值對分配系數(shù)(K)的影響,結(jié)果如圖4所示。2.1.5升溫對茶葉黃酮分配的影響取5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的Na2SO4和質(zhì)量為6g的PEG600組成雙水相體系,在pH為5,溫度在25～45℃之間,用恒溫水浴鍋提供合適的溫度環(huán)境,以考察不同溫度對茶葉黃酮分配行為的影響,結(jié)果如圖5所示。升溫有利于雙水相的形成。原來還沒來得及分相的體系,在溫度提高后相分離速度隨著溫度的升高而加快,而R值則隨著溫度的升高而降低,這主要是因?yàn)闇囟壬邥r(shí),PEG在水中的溶解度增加,PEG分子部分轉(zhuǎn)移到富含水的下相,導(dǎo)致上相體積減小、下相體積增大。由圖5可知,最合適的溫度是30℃時(shí)茶葉黃酮得率最高。2.1.6mgcl2添加量對黃酮分配的影響以6gPEG600和5mL的15%Na2SO4作為研究體系,在pH值5、溫度30℃時(shí),考察MgCl2的添加量對茶葉黃酮分配的影響。無機(jī)鹽的加入改變了兩相間的電位差,從而縮短分相時(shí)間,提高了相分離速度,也可使一些原來不分相的體系分相,并降低R值,茶葉黃酮的K值增大。2.2試驗(yàn)結(jié)果及反應(yīng)分析2.2.1黃酮在雙水相系統(tǒng)中的分配性能分析根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)3次試驗(yàn)所得茶葉黃酮在上相中的得率的平均值為響應(yīng)值,試驗(yàn)結(jié)果見表2。2.2.2回歸方程和模型分析以Y提取率(%)為響應(yīng)值,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,用SAS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行多元回歸分析,所得的主要分析結(jié)果見圖7～圖9。Y=96.2633-0.1725X1-0.8300X2-1.0450X3-2.1454X12-2.6075X1X2-1.4575X1X3-2.9054X22-5.3975X2X3-3.3704X32根據(jù)SAS軟件輸出結(jié)果可知,響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對各因素(X1、X2、X3)所構(gòu)成三維空間的曲面圖,根據(jù)上述回歸方程作出響應(yīng)面分析圖(圖7～圖9)。每個(gè)響應(yīng)面分別代表著3個(gè)獨(dú)立變量之間的相互作用,此時(shí)第3個(gè)變量保持在最佳水平。由圖7～圖9可看出,PEG600的質(zhì)量對茶總黃酮得率的影響最為顯著,表現(xiàn)為曲線較陡;而Na2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)和MgCl2添加量次之,表現(xiàn)為曲線較為平滑。模型回歸方程方差分析如表3,Pr>F為0.0077,R2為0.9535,回歸顯著。所得提取總黃酮最佳工藝條件為:Na2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15.0909%,PEG600的質(zhì)量為5.9870g,MgCl2添加量為2.8515%,此時(shí)總黃酮提取率為96.3448%,并結(jié)合單因素試驗(yàn),pH值為5,溫度為30℃。但考慮到實(shí)際操作的可行性,將上述優(yōu)化得到最佳工藝條件修正為:pH值為5,溫度為30℃,Na2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%,PEG600的質(zhì)量為6g,MgCl2添加量為2.9%。2.2.3次回歸模型應(yīng)用為檢驗(yàn)響應(yīng)面法的可靠性,試驗(yàn)采用上述最優(yōu)提取條件進(jìn)行超聲波輔助提取總黃酮試驗(yàn),所得試驗(yàn)結(jié)果為(96.31±0.85)%,實(shí)測值與理論預(yù)測值極為接近,相對偏差為0.9%,說明二次回歸模型適合本試驗(yàn),能夠描述整個(gè)試驗(yàn)中各變量與響應(yīng)值之間的關(guān)系,得到的提取條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠,具有使用價(jià)值。2.3黃酮的抗逆性2.3.1還原能力的測定以BHT和Vc為對照測定了茶葉總黃酮提取物的總還原力(見圖10),總還原能力隨茶葉總黃酮提取物濃度的增加而升高。在80μg/mL以內(nèi),總黃酮提取物在700nm處的吸光度與BHT和Vc差別不大,可見茶葉總黃酮提取物具有極強(qiáng)的還原能力。物質(zhì)的還原能力是確定其潛在抗氧化活性的重要指標(biāo),還原能力大的樣品是良好的電子供體可以通過提供電子使自由基變?yōu)榉€(wěn)定的物質(zhì),中止自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng),同時(shí),可與過氧化物的前體物質(zhì)作用而阻止過氧化物的產(chǎn)生,起到抗氧化的作用,結(jié)果表明,茶葉黃酮具有一定的還原能力,可潛在用于抗氧化劑的研發(fā)。3兩相分離分離雙水相萃取法,由2種水溶性高分子化合物與1種鹽類在水中所形成的互不相溶的兩相體系,由于被分離物在兩相中分配不同,便可實(shí)現(xiàn)分離。由于雙水相萃取技術(shù)在微生物、有機(jī)化合物等的分離和純化、預(yù)濃集過程中表現(xiàn)出相當(dāng)好的性能,并有望用于大規(guī)模提取和純化生物活性物質(zhì),因此越來越受到人們的關(guān)注和重視。2.3.2綠茶總黃酮提取的響應(yīng)面試驗(yàn)茶葉黃酮對DPPH清除效果如圖11所示,在試驗(yàn)濃度范圍,不同濃度的茶葉黃酮對DPPH清除率隨濃度的提高而增大,當(dāng)濃度較高時(shí),如80μg/mL趨于平緩,比Vc的清除能力稍低,比BHT稍高,可見茶葉黃酮具有較強(qiáng)的清除羥自由基的能力,其機(jī)制可能是由于其主要成分被羥基降解的緣故。本試驗(yàn)引入聚乙二醇/鹽雙水相體系結(jié)合超聲波萃取茶葉中的黃酮,不同分子量的PEG和不同鹽不同鹽濃度進(jìn)行試驗(yàn),以PEG600/Na2SO4組成的雙水相萃取率為好。將Box-Behnken設(shè)計(jì)與響應(yīng)面分析法相結(jié)合,快速、有效地從影響綠茶總黃酮得率的因素中篩選出主要的影響因素,避免了非主要因素可能造成的浪費(fèi)時(shí)間和資源的缺陷,并且利用響應(yīng)面分析法實(shí)現(xiàn)條件優(yōu)化,優(yōu)化得到的預(yù)測結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果較吻合。茶葉黃酮提取率工藝參數(shù)的回歸方程為:先稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.0138g,用50%乙醇,溶解,容量瓶定容至100mL,用50%乙醇稀釋至刻度,搖勻,得到質(zhì)量濃度為0.138mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。吸取配制好的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL分別加入0.1mol/L的氯化鋁6mL,pH5.5的HAc-KAc緩沖溶液5mL,50%乙醇定容至50mL,搖勻,放置30min。以50%乙醇為參比,用紫外分光光度計(jì)于波長273nm處測其吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度X(mg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度值Y為縱坐標(biāo),擬合的關(guān)系式如下:Y=31.379X+0.0175(R2=0.9936)。對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合回歸,以提取率Y為因變量,Na2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為X1、PEG600的質(zhì)量為X2、MgCl2添加量為X3為自變量建立回歸方程如下:Box-Behnken中心組合方法是針對因子數(shù)較多,且未確定眾因子相對于響應(yīng)變量的顯著性而采用的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,對顯著影響的因子可以確定出來,從而達(dá)到篩選的目的,避免在后期的優(yōu)化試驗(yàn)中由于因子數(shù)太多或部分因子不顯著而浪費(fèi)試驗(yàn)資源。響應(yīng)面分析法是一種優(yōu)化多變量系統(tǒng)的有效試驗(yàn)工具。它是研究因素與響應(yīng)值之間、因素間的交相作用,找出整個(gè)區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值,對實(shí)際生產(chǎn)更有指導(dǎo)意義。Y=96.2633-0.1725X1-0.8300X2-1.0450X3-2.1454X12-2.6075X1X2-1.4575X1X3-2.9054X22-5.3975X2X3-3.3704X32。方差分析結(jié)果表明擬合檢驗(yàn)極顯著,決定系數(shù)R2達(dá)0.9535,該方程能較好的預(yù)測茶葉黃酮提取率隨各參數(shù)變化的規(guī)律。優(yōu)化后綠茶總黃酮提取最佳條件為:pH值為5,溫度為30℃,5mL的15%Na2SO4,PEG600的質(zhì)量為6g,MgCl2添加量為2.9%,此工藝條件下的茶葉黃酮提取率為96.31%;采用鐵還原能力法和DPPH法對茶葉黃酮的抗氧化活性進(jìn)行體外評價(jià),總還原能力隨茶葉總黃酮提取物濃度的增加而升高。在80μg/mL以內(nèi),總黃酮吸光度與BHT和Vc差別不大,具有極強(qiáng)的還原能力。不同濃度的茶葉黃酮對DPPH清除率隨濃度的提高而增大,當(dāng)濃度達(dá)80μg/mL時(shí),茶葉黃酮對DPPH清除率與BHT和Vc相當(dāng),可見茶葉黃酮具有較強(qiáng)的清除羥自由基的能力。由圖1可看出,PEG分子量越低,其親水性愈強(qiáng),對憎水性的茶葉黃酮而言,不易分配于富含PEG的相,則K值愈小;試驗(yàn)中PEG400的黃酮得率為45.8%低于50%,得率反而比一般溶劑低,可能是由于PEG分子量較小,空間位阻較小;隨著PEG分子量的增大,其空間阻力相應(yīng)增大,疏水性增大,根據(jù)相似相溶原理,更多的茶葉黃酮分配在上相;但PEG分子量過大,系統(tǒng)粘度過大,影響傳質(zhì),K值反而會下降;茶葉黃酮在PEG600與15%Na2SO4形成的雙水相體系中得率最高,因此選擇分子量較小的PEG600更為合適。取5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的Na2SO4和不同質(zhì)量的PEG600分別組成雙水相體系作為研究體系,在pH為9,溫度為30℃的條件下,考察茶葉中黃酮的分配情況,結(jié)果見圖2。由圖2可知,PEG600的質(zhì)量低于3g時(shí),不形成雙水相,而當(dāng)其質(zhì)量高于3g時(shí),則成相明顯。但隨著PEG600質(zhì)量的增大,系統(tǒng)遠(yuǎn)離臨界點(diǎn),兩相差別增大,易于形成兩相,空間位阻增加,富含PEG600相的疏水性增加,使疏水性較強(qiáng)的茶葉黃酮類化合物趨向于含PEG600較多的上相,則K值增大;但PEG600質(zhì)量過大,系統(tǒng)粘度增大,影響傳質(zhì),則K值下降。因此選擇質(zhì)量為6g(即6%)的PEG600最為合適。選擇4種不同鹽(硫酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫酸銨)及其5mL5種不同質(zhì)量濃度(5%、10%、15%、