實驗3：細菌的分離與純化

實驗3微生物的純種分離培養(yǎng)微生物廣泛地分布在自然界的土樣、水體、空氣、動植物體表及人體、動物體的排泄物中。它們以單個的菌體、無性孢子和芽孢的形式存在。由于單一的自然界環(huán)境并不能完全滿足微生物對水、空氣、營養(yǎng)物質(zhì)、溫度、pH的綜合要求，它們往往以散居”的狀態(tài)出現(xiàn)，而不能形成人們?nèi)庋劭芍苯佑^察到菌落。不同的自然環(huán)境中，微生物的種類和數(shù)量差異很大。肥沃的土壤，富養(yǎng)化的水體，是許多微生物麇集、孳生的場所，在這里存活著能分解淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、纖維素、木質(zhì)素、果膠、農(nóng)藥、含磷有機物（卵磷脂、肌醇、核酸等）、石油以及溶解銅礦的細菌、放線菌、真菌等多種類的微生物，如何根據(jù)微生物的生理要求，按照人類的需求，將它們從自然界中分離出來，獲得純種，發(fā)揮微生物的特長為人類的生產(chǎn)和生活服務(wù)，是微生物研究中最基礎(chǔ)的實驗技術(shù)。一、 實驗?zāi)康?．學(xué)會將混雜的各種微生物分離成純種，統(tǒng)計分析樣品中微生物的種類和數(shù)量的方法。2．學(xué)會從菌落及培養(yǎng)特征區(qū)分細菌、酵母菌、放線菌和霉菌。3．學(xué)會好氧微生物平板及斜面培養(yǎng)的方法。二、 實驗原理：在自然界中，微生物的種類很多，數(shù)量很大，為了獲得單個菌體，首先必須把要分離的材料進行適當(dāng)?shù)尼尫?，按其生長所需要的條件，使其在平板上，由一個菌體繁殖成單個菌落，這樣，就能從中挑選出所需要的純種，由于細菌、放線菌和霉菌所要求的營養(yǎng)條件不同，利用不同的培養(yǎng)基制成平板進行分離，然后從菌落形態(tài)上的差異，可以把細菌、放線菌和霉菌三大類群區(qū)分并可計算出其數(shù)量，分別接種到試管斜面上，然后，在平板上反復(fù)進行分離培養(yǎng)，最后可獲得純種。三、實驗材料和用具：1．材料（1）土壤樣品（2）培養(yǎng)基：①牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（%）牛肉膏0?3-0?5g蛋白胨1?0gNaCl0?5g瓊脂2?0g蒸餾水100mLpH7?2-7?4,0?1Mpa壓力，滅菌20-30分鐘。配制液體培養(yǎng)基時不加瓊脂；半固體培養(yǎng)基加0?3-0.5%瓊脂。該培養(yǎng)基為多數(shù)細菌通用培養(yǎng)基，可用于菌種的分離純化及保藏斜面。2．用具無菌培養(yǎng)皿、無菌吸管、無菌水、酒精燈、接種環(huán)、接種針、火柴等。四、實驗方法：1．稀釋涂布平板法：（1）倒平板彳將滅菌的培養(yǎng)基加熱融化，倒平板。瓊脂是固體培養(yǎng)的支持物，它在 95C融化，40C以下凝固，將已滅菌的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基融化后（水浴融化）冷卻至掉或燙死；溫度過低，則培養(yǎng)基凝固，不易倒出）。45-50的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基融化后（水浴融化）冷卻至掉或燙死；溫度過低，則培養(yǎng)基凝固，不易倒出）。45-50C（溫度過高，培養(yǎng)皿蓋上凝結(jié)水太多，菌易被沖倒平板方法：右手的虎口、姆指和食指握住三角瓶，左手翻轉(zhuǎn)手掌，以無名指與小指在火焰處拔出棉塞（或塑料試管帽、硅膠泡沫塞），微燒瓶口一周，左手把皿蓋打一縫，容三角瓶口探入（見圖 1）傾入培養(yǎng)基后，迅速將皿蓋蓋妥，平放桌上，輕輕旋轉(zhuǎn)，使培養(yǎng)基與土壤稀釋液充分混勻，待凝固后，即成平板。（2）稀釋土樣：稱1°克土樣，在火焰旁加到有90mL無菌水和少許玻璃珠的三角燒瓶內(nèi)，將瓶子依左右方向振蕩數(shù)十次（或-1在振蕩器上振蕩分散），使土樣與水充分混合，將菌分散，土樣中的菌被稀釋了10倍，土壤懸液的稀釋度為10。在火焰處打開無菌吸管的紙?zhí)祝ɑ蛴梦⒘考訕悠餮b上無菌的塑料吸嘴），用無菌吸管吸取土壤懸液 1mL，加到一個盛有9mL無菌水的試管內(nèi)，稀釋100倍制成稀釋度為10-2的土壤懸液，將此吸管在試管內(nèi)反復(fù)吹洗3次，然后取出，通過火焰，再插入紙?zhí)變?nèi)，以備再用。輕輕搖動試管，使菌液均勻。再用剛才用過的吸管，插入試管內(nèi)，反-3復(fù)吹洗3次，然后取出1mL菌液，加到另一支9mL無菌水中，制成稀釋度為10的土壤懸液（圖2）。用微量加樣圖1將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿內(nèi)-4 -5 -6器亦需反復(fù)吸吹3次，用畢棄去塑料吸嘴。同法按每級稀釋 10倍的次序得到10、10、10的土壤稀釋液。

圖2稀釋過程示意圖圖2稀釋過程示意圖涂布及培養(yǎng)-6將上述稀釋好的土壤菌液，用最后一支吸管(或塑料吸嘴)，由最小的稀釋液( 10)開始吸取0?1mL加到-6-5-4編號為10的培養(yǎng)皿中央，再依次分別從 10、10試管中各吸取0?1mL稀釋液，加到相應(yīng)編號的培養(yǎng)皿中央，每次吸取時，吸管都要在稀釋液中反復(fù)吹洗幾次。 用無菌玻璃棒按照圖3所示，在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻，靜止5-10min，使菌液吸附進培養(yǎng)基。將培養(yǎng)皿倒置于 37C的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1-3天，每24h觀察一下菌落的生長狀態(tài)，并記錄細菌、霉菌菌落的數(shù)目并描述所見菌落的形態(tài)。圖3圖3平板涂布操作圖挑菌落將培養(yǎng)出的單個菌落分別挑取少許細胞接種到斜面培養(yǎng)基上。置于 37C的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待菌苔長出后，檢查其特征是否一致，同時將細胞涂片染色后用顯微鏡檢查是否是單一微生物。若發(fā)現(xiàn)有雜菌，需要再一次進行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。斜面接種技術(shù)：操作時按圖4的順序，并注意教師的示范操作。試管先貼上標(biāo)簽，注明菌名、日期和姓名，然后將菌種斜面和欲接種斜面試管架在左手虎口之上，用食指和中指夾住試管,大姆指按在二管中央，菌種管口在外方，斜面稍朝上。

先將棉塞（或塑料帽、硅膠泡沫塞）用右手扭轉(zhuǎn)松動，以利接種時拔出。右手拿接種環(huán)末端，使其垂直于火焰中，燒紅滅菌。用右手小指、無名指和手掌拔掉棉塞。以火焰灼燒管口，燒時應(yīng)不斷轉(zhuǎn)動試管口，使試管口沾染的少量雜菌得以燒死。將燒過的接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，先將環(huán)接觸沒有長菌的培養(yǎng)基部分，使其冷卻，以免燙死被接種的菌體,然后輕輕接觸菌體，取出少許，慢慢將接種環(huán)抽出試管。迅速將接種環(huán)在火旁伸進欲接種試管，在培養(yǎng)基上輕輕劃蛇形線，劃線時要由底部到頂部，由下而上，但不要把培養(yǎng)基劃破，也不要使菌種污染管壁。火焰灼燒試管口，并在火旁將塞塞上，塞棉塞時，不要用試管去迎棉塞，以免試管在運動時污染雜菌。放回接種環(huán)前，將環(huán)在火焰上再燒紅滅菌，放下接種環(huán)后，再騰出手將棉塞塞緊。irl(21irl(21圖4斜面接種技術(shù)2平板劃線分離法為了保證菌落為單克隆，在稀釋涂布平板培養(yǎng)分離的基礎(chǔ)上進行平板劃線再分離操作。（1）倒平板：按照稀釋涂布平板法倒平板，并用記號筆標(biāo)明培養(yǎng)基名稱、菌落編號和實驗日期。（2）劃線：左手持皿底，平板面向上，稍斜，靠近火焰，用接種環(huán)取稀釋涂布平板培養(yǎng)的細菌菌落一環(huán)在平板上劃線，劃線分離后，置于 37C溫箱中，培養(yǎng)1~2天，即出現(xiàn)單個菌落。劃線方法一：用接種環(huán)以無菌操作取細菌懸液一環(huán)，在平板培養(yǎng)基的一邊，做第一次平行劃線2~3條。轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿約70°角，用燒過冷卻的接種環(huán)，通過第一次劃線部分，做第二次平行劃線。用同法通過第二次平行劃線，做第三次平行劃線。

圖5圖5劃線分離方式1、2、3表示劃線次序劃線方法二：先以沾有細菌懸液的接種環(huán)在平板的一端涂抹一下，使該處沾上一些細菌，然后，燒掉環(huán)上剩下的細菌，再用燒過冷卻的接種環(huán)，通過剛才涂抹的部分，左右劃線，不能互相接觸(圖 5)。劃線時，注意接種環(huán)與平板表面約成20~30。角，劃線分離對細菌、酵母菌較為適宜，而霉菌和放線菌的分離多采用稀釋分離法。3?根據(jù)菌落及培養(yǎng)特征鑒別微生物的類型由于微生物個體表面結(jié)構(gòu)、分裂方式、運動能力、生理特性以及產(chǎn)生色素的能力等各不相同。因而個體在固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基上生長的情況，往往各有特點，按照微生物在固體培養(yǎng)基上形成菌落的特征，可用來初步辨別是何種類型的微生物，應(yīng)注意菌落特征的形狀、構(gòu)造、大小、顏色、透明度、氣味及粘滯性等。一般來說，(1)細菌和酵母的菌落是比較濕潤的，用接種環(huán)極易將菌體挑起。放線菌的菌落硬度較大，干燥致密，且與培養(yǎng)基緊密結(jié)合，不易被針挑起。霉菌菌落呈蛛網(wǎng)狀、絨狀或棉絮狀。如果要鑒定菌種，則對于微生物在液體培養(yǎng)基中以及在斜面培養(yǎng)基上生長的特征都應(yīng)比較詳細地觀察，通常用接種針挑取菌體少許，在斜面上由下到上部劃成直線接種，培養(yǎng)后，觀察生長旺盛的程度，形狀，顏色及光澤等(圖6)。AVQ-8如*林熔林特征圖6平板上細菌菌落和斜面劃線生長的形狀五、實驗內(nèi)容：1.按教師指定的小組進行從土樣中用釋釋分離法分離細菌，待單菌落長出后，移接斜面培養(yǎng)，并計算出每克土中樣微生物的數(shù)量。2.從稀釋涂布平板上挑去疑似單菌落用平板劃線法進一步分離出細菌的單菌落，純化，并移接斜面培養(yǎng)。六、實驗報告：1?選擇剛好能把菌分開，而稀釋倍數(shù)最低的平板（一般含菌落 20-300個），計算每克土中樣微生物的數(shù)量：平均菌薄數(shù)兀韓降倍數(shù)微牛羽的蒯羽劇『個陽罰= 亠土