寄生蟲實驗診斷方法

寄生蟲感染的診斷1臨床診斷：A病史、癥狀、體征B物理診斷：X線、B超、CT、MRI2實驗室檢查：A病原學方法：糞便檢查；血液檢查；排泄物分泌物檢查；其他器官組織檢查B免疫學方法C分子生物學方法（一）糞便檢查：直接涂片法；厚涂片法；濃集法；毛蚴孵化法；肛門拭子檢查法；鉤蚴培養(yǎng)法；蟲卵計數(shù)法；定量透明法；帶絳蟲孕節(jié)檢查法。糞便檢查是診斷寄生蟲病常用的方法。要取得準確的結(jié)果1）糞便必須新鮮，送檢時間一般不宜超過24小時； 2）盛糞便的容器要干凈，并防止污染與干燥；3）糞便不可混雜尿液等，以免影響檢查結(jié)果； 4）取材部位：盡可能取病變部位。直接涂片法:用以檢查蠕蟲卵、原蟲的包囊和滋養(yǎng)體。方法簡便，適用范圍廣，但檢出率相對較低。一般要求連續(xù)作3次涂片，可提高檢出率。⑴蠕蟲卵檢查：方法：一般在低倍鏡下檢查，如用高倍鏡觀察，需加蓋片。應注意蟲卵與糞便中異物的鑒別。蟲卵都具有一定形狀和大??；卵殼表面光滑整齊，具固有色澤；卵內(nèi)含卵細胞或幼蟲。⑵原蟲檢查：1）活滋養(yǎng)體檢查：方法同查蠕蟲卵。注意事項。2）包囊的碘液染色檢查：方法同上，以一滴碘液代替生理鹽水。若同時需檢查活滋養(yǎng)體，可在用生理鹽水涂勻的糞滴附近滴一滴碘液，再蓋上蓋片。涂片染色的一半查包囊；末染色的一半查活滋養(yǎng)體。3）隱孢子蟲卵囊染色檢查：目前較佳的方法為金胺酚改良抗酸染色

法。對于新鮮糞便或經(jīng)10％福爾馬林固定保存的含卵囊糞便都可用此法染色。染色過程是先用金胺－酚染色，再用改良抗酸染色法復染。厚涂片透明法（改良加藤法）取約5mg糞便，置于載玻片上，覆以浸透甘迪一孔雀綠溶液的玻璃紙片，輕壓，使糞便鋪開（20X25mm）。待糞膜稍干，即可鏡檢。玻璃紙準備：將玻璃紙浸于甘油－孔雀綠溶液中，至少浸泡24小時，至玻璃紙呈現(xiàn)綠色。使用此法需掌握糞膜的合適厚度和透明的時間。如糞膜厚，透明時間短，蟲卵難以發(fā)現(xiàn)；如透明時間過長，則蟲卵變形，也不易辨認。沉淀法：原蟲包囊和蠕蟲卵的比重大可沉集于水底，有助于提高檢出率。但比重較小的鉤蟲卵和某些原蟲包囊則效果較差。 方法：自然沉淀法；離心沉淀法；醛醚沉淀法；自然沉淀法：取糞便20?30g、加水成混懸液，經(jīng)金屬篩過濾，再加清水沖洗殘渣；過濾糞液在容器中靜置25分鐘，倒去上液，重新加滿清水，以后每隔15?20分鐘換水一次（3?4次），直至上液清晰為止。最后倒去上液，取沉渣作涂片鏡檢。離心沉淀法：將上述濾去粗渣的糞液離心（1500?2000rpm/min）1?2分鐘，倒去上液，注入清水，再離心沉淀，如此反復沉淀3?4次，直至上液澄清為止，最后倒去上液，取沉渣鏡檢。醚沉淀法：置糞便醚沉淀法：置糞便1?2g加水10?20ml調(diào)勻，將糞便混懸液過濾，離心（2000rpm）2分鐘；倒去上層糞液，加水10ml混勻，離心2分鐘；倒去上液，加10%甲醛7ml。5分鐘后加乙醚3ml,塞緊管口并充分搖勻，取下管口塞，離心2分鐘，即可見管內(nèi)自下而上分為4層。取管底沉渣涂片鏡檢。如檢查原蟲包囊，可加盧戈氏液染色，加蓋片鏡檢。浮聚法：利用比重較大的液體，使原蟲包囊或蠕蟲卵上浮，集中于液體表面。常用的方法有三種：1.飽和鹽水浮聚法；2.硫酸鋅離心浮聚法；3.蔗糖離心浮聚法飽和鹽水浮聚法：此法用以檢查鉤蟲卵效果最好。方法、優(yōu)缺點、適用范圍。飽和鹽水配制：將食鹽徐徐加入盛有沸水的容器內(nèi)，不斷攪動，直至食鹽不再溶解為止硫酸鋅離心浮聚法：此法可用于檢查原蟲包囊，球蟲卵囊和蠕蟲卵。取糞便約1g,加水充分攪碎，按離心沉淀法過濾，反復離心3?4次，至水清為止，最后倒去上液，在沉渣中加入比重1.18的硫酸鋅液（33%的溶液），調(diào)勻后再加硫酸鋅溶液至距管口約lcm處，離心1分鐘。用金屬環(huán)取表面的糞液置于載玻片上，加碘液一滴，鏡檢。蔗糖離心浮聚法：此法適用于檢查糞便中隱孢子蟲的卵囊。取糞便約加水并過濾。取濾液離心5?10分鐘，吸棄上清液，加蔗糖溶液再離心，然后如同飽和鹽水浮聚法，取其表液膜鏡檢（高倍或油鏡）。卵囊透明無色，隱孢子蟲的卵囊在漂浮液中浮力較大，常緊貼于蓋片之下，但1小時后卵囊脫水變形不易辨認，故應立即鏡檢。也可用飽和硫酸鋅溶液或飽和鹽水替代蔗糖溶液。毛蚴孵化法取糞便約30g，先經(jīng)重力沉淀法濃集處理，將糞便沉渣倒入三角燒瓶內(nèi)，加清水（去氯水）至瓶口，在20?30°C的條件下經(jīng)4?6小時后肉眼或放大鏡觀察結(jié)果。,如見水面下有白色點狀物作直線來往游動，即是毛蚴。肛門拭子檢查法適用于在肛周產(chǎn)卵（蟯蟲），或常在肛門附近發(fā)現(xiàn)蟲卵（牛帶絳蟲）的蟲卵檢查法。棉簽拭子法：用浸泡生理鹽水的棉簽，在肛門周圍擦拭，隨后將棉簽放入盛有飽和鹽水的試管中，用力攪動，迅速提起棉簽并棄去，再加飽和鹽水至管口處，覆蓋一載玻片，5分鐘后取載玻片鏡檢。也可將擦拭肛周的棉簽放在盛清水的試管中，經(jīng)充分浸泡，取出，棄去。試管靜置10分鐘，或經(jīng)離心后，倒去上液，取沉渣鏡檢。透明膠紙法：用長約6cm,寬約2cm的透明膠紙粘擦肛門周圍的皮膚，取下膠紙，將有膠面平貼玻片上，鏡檢。鉤蚴培養(yǎng)法：根據(jù)鉤蟲卵在適宜條件下可在短時間內(nèi)孵出幼蟲的原理設計的方法。蟲卵計數(shù)法:蟲卵計數(shù)用于估計人體內(nèi)寄生蟲的感染度，常用司徒爾（Stoll）氏法，即司氏稀釋蟲卵計數(shù)法定量透明法適用于各種糞便內(nèi)蠕蟲卵的檢查及計數(shù)。方法：將所得蟲卵數(shù)X24，再乘上述糞便性狀系數(shù)，即為每克糞便蟲卵數(shù)（eggspergram，EPG）。（二）血清檢查：是診斷瘧疾、絲蟲病的基本方法。涂制血膜用的載玻片用前需經(jīng)洗滌液處理，自來水、蒸餾水沖洗，在95％酒精中浸泡，擦干或烤干后使用。厚薄血膜同片制作:檢查瘧原蟲。操作步驟、優(yōu)缺點檢查微絲蚴⑴新鮮血片檢查：晚間9時至次晨2時取血1滴滴于載玻片上，加蓋片，在低倍鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)蛇形游動的幼蟲后，仍須作染色檢查，以確定蟲種。⑵厚血膜檢查：厚血膜的制作、溶血、固定與姬氏液染色同瘧原蟲。但需取血3滴，也可用蘇木素染色法染色。（三）排泄物與分泌物等的檢查痰液痰中可能查見肺吸蟲卵、溶組織內(nèi)阿米巴滋養(yǎng)體、棘球蚴的原頭蚴、糞類圓線蟲幼蟲、蛔蚴、鉤蚴、塵螨等；卡氏肺孢子蟲的包囊也可出現(xiàn)于痰中，但檢出率很低。肺吸蟲卵檢查：直接涂片法；濃集法直接涂片法：在潔凈載玻片上先加1?2滴生理鹽水，挑取痰液少許，最好選帶鐵銹色的痰，涂成痰膜，加蓋片鏡檢。如未發(fā)現(xiàn)肺吸蟲卵，但見有夏科－雷登晶體，提示可能是肺吸蟲患者。濃集法：收集24小時痰液，置于玻璃杯中，加入等量10%NaOH溶液，使痰液消化成稀液狀。以1500rpm離心5?10分鐘，棄去上清液，取沉渣滴涂片檢查。溶組織內(nèi)阿米巴大滋養(yǎng)體檢查：取新鮮痰液作涂片。天冷時應注意鏡臺載玻片保溫。高倍鏡觀察。如為阿米巴滋養(yǎng)體，可見其伸出偽足并作定向運動。十二指腸液和膽汁用十二指腸引流管抽取十二指腸液及膽汁，以直接涂片法鏡檢；也可經(jīng)離心濃集后，吸取沉渣鏡檢?？蓹z查藍氏賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體、華支睪吸蟲卵、肝片形吸血卵和布氏姜片蟲卵等；急性阿米巴肝膿腫患者偶在膽汁中發(fā)現(xiàn)大滋養(yǎng)體。尿一般先離心，后取沉渣鏡檢。但乳糜尿需加等量乙醚，用力振蕩，使脂肪溶于乙醚。然后吸去脂肪層，離心，取沉渣鏡檢。鞘膜積液主要檢查班氏微絲蚴。陰囊皮膚經(jīng)碘酒精消毒后，用注射器抽取鞘膜積液作直接涂片檢查，也可加適量生理鹽水稀釋離心，取沉渣鏡檢。陰道分泌物檢查陰道毛滴蟲其它器官組織檢查1．骨髓穿刺主要檢查杜氏利什曼原蟲無鞭毛體。一般常作髂骨穿刺，取少許骨髓液作涂片；甲醇固定，同薄血膜染色法染色，油鏡檢淋巴結(jié)穿刺⑴利什曼原蟲：檢出率低于骨髓穿刺，但方法簡便、安全，且有一定療效考核價值。淋巴結(jié)組織液注于載玻片上，作涂片染色檢查。也可用摘除的淋巴結(jié)的切面做涂片，染色后鏡檢。⑵絲蟲成蟲：可用注射器從可疑的淋巴結(jié)節(jié)中抽取成蟲，或剖檢摘除的結(jié)節(jié)尋找成蟲，也可作病理組織切片檢查。肌肉活檢⑴旋毛蟲幼蟲從患者的腓腸肌或肱或股二頭肌取米粒大小的肌肉一塊，置于載玻片上，加50％甘油滴，蓋上另一載玻片，均勻用力壓緊，低倍鏡下觀察。取下肌肉須立即檢查，否則幼蟲變得模糊，不易檢查。⑵豬囊尾蚴：摘取肌肉內(nèi)的結(jié)節(jié)，剝除外層纖維被膜，在2張載玻片間壓平、鏡檢。也可經(jīng)組織固定后作切片染色檢查。皮膚：檢查疥螨，蠕形螨，利什曼原蟲等。⑴疥螨：⑵蠕形螨：⑶利什曼原蟲：直腸粘膜：用直腸鏡從直腸粘膜病變組織內(nèi)可查見日本血吸蟲卵及溶組織阿米巴滋養(yǎng)體。日本血吸蟲卵：用直腸鏡自直腸取米粒大小的粘膜一塊，經(jīng)水洗后，放在2載玻片間，輕輕壓平，鏡檢溶組織阿米巴：用乙狀結(jié)腸鏡觀察潰瘍形狀，自潰瘍邊緣或深層刮取潰瘍組織，置于載玻片上，加少量生理鹽水，蓋上蓋片，輕輕壓平，立即鏡檢。也可取出一小塊病變的粘膜組織，固定切片，染色檢查。免疫學診斷環(huán)卵沉淀試驗（COPT）是以血吸蟲整卵為抗原的特異免疫血清學試驗原理：卵內(nèi)毛蚴或胚胎分泌排泄的抗原物質(zhì)經(jīng)卵殼微孔滲出與檢測血清內(nèi)的特異抗體結(jié)合，可在蟲卵周圍形成特殊的復合物沉淀，在光鏡下判讀反應強度并計數(shù)反應卵的百分率稱環(huán)沉率。方法：塑料管法COPT:雙面膠紙法COPT:PVF抗原膜片法：血凝板法:組織內(nèi)環(huán)卵沉淀反應:酶聯(lián)環(huán)卵沉淀反應方法評價:COPT可作為診斷血吸蟲病的血清學方法之一，及臨床治療病人的依據(jù)；可用作考核治療和防治效果的方法；并且用于血清流行病學調(diào)查及監(jiān)測疫情的方法。皮內(nèi)試驗：利用宿主的速發(fā)型變態(tài)反應，將特異抗原液注入皮內(nèi)，觀測皮丘及紅暈反應以判斷有無特異抗體（IgE）的存在稱皮內(nèi)試驗（IDT）。方法:取皮試液0.1ml作皮內(nèi)注射，20min后判斷皮試結(jié)果。結(jié)果判斷標準：陰性：局部無紅腫、無異常全身反應。陽性：皮丘紅腫，硬結(jié)直徑大于1.5cm，紅暈范圍直徑超過4cm，有時出現(xiàn)偽足或有癢感.皮內(nèi)試驗用于多種寄生蟲病的檢測，如血吸蟲病、肺吸蟲病等。最常用于血吸蟲病的調(diào)查。操作簡單，并且可即時觀察結(jié)果，適宜現(xiàn)場應用。大多用粗制可溶性血吸蟲蟲卵抗原（稀釋度為1：4000）或成蟲冷浸抗原（稀釋度為1：8000），其陽性率在93%?97%，但有部分假陽性反應（2.1%?3.5%），并且對其他寄生蟲病交叉反應較高。皮內(nèi)試驗的應用范圍：①過篩方法，先作皮試，陽性者再作進一步追查；②臨床輔助診斷；③考核預防效果，用作檢查新感染的方法，特別對兒童。染色試驗（DT）是比較獨特的免疫反應，是目前診斷弓形蟲病較好的方法，可用于該病的臨床診斷和流行病學調(diào)查原理：新鮮活弓形蟲滋養(yǎng)體胞質(zhì)對堿性美藍有很強的親和性，能被染成藍色；但當弓形蟲受特異性抗體和輔助因子協(xié)同作用后，細胞變性、細胞膜破裂，細胞質(zhì)外溢，蟲體不著色。新鮮弓形蟲滋養(yǎng)體和正常血清混合，在37°C作用1小時或室溫數(shù)小時后，大部分弓形蟲失去原來的新月形，而變?yōu)閳A形或橢圓形，用堿性美藍染色時著色很深。但新鮮弓形蟲和免疫血清混合時，蟲體仍保持原有形態(tài)，用堿性美藍染色時，著色很淺或不著色。其原因可能是由于弓形蟲受到特異體抗體和輔助因子協(xié)同作用后，蟲體細胞變性，結(jié)果蟲體對堿性美藍不易著色。方法：將經(jīng)56度30min滅活的待測血清同滋養(yǎng)體和輔助因子共同作用后加美藍染色，如有50%或以上不著色者即為陽性?？墒?0%蟲體不著色的血清稀釋度即為血清陽性滴度。結(jié)果判斷：1：8為隱性感染；1：256為活動性感染；1：1024為急性感染。間接血凝試驗（IHA）原理：以人0型紅細胞或綿羊紅細胞為載體，經(jīng)特殊處理后結(jié)合上特異性抗原，即為致敏紅細胞。在遇到相應的抗體時發(fā)生特異性結(jié)合，致使紅細胞產(chǎn)生交聯(lián)而凝集成肉眼可見的團塊，即為陽性。如無特異性的抗體則紅細胞不發(fā)生凝集而沉于底部，為陰性。間接血凝抑制試驗：用已知抗原或抗體預先與待測標本作用，以中和相應的抗體或抗原，再加入相應的致敏紅細胞，如無法交聯(lián)而不發(fā)生凝集則為陽性。根據(jù)紅細胞在孔底的沉積類型而定。“－”，紅細胞沉于管底，呈圓點形，外周光滑；“±”，紅細胞沉于管底，周圍不光滑或中心有白色小點；“＋”，紅細胞沉積范圍很小，呈較明顯的環(huán)形圈“＋＋”，紅細胞沉積范圍較小，其中可出現(xiàn)淡淡的環(huán)形圈；“＋＋＋”，紅細胞布滿管底呈毛玻璃狀；“＋＋＋＋”，紅細胞呈片狀凝集或邊緣卷曲。呈明顯陽性反應（＋）的最高稀釋度為該血清的滴度或效價。間接熒光抗體法（IFA）原理：將抗原與未標記的特異性抗體（如患者血清）結(jié)合，然后使之與熒光標記的抗免疫球蛋白抗體（抗抗體）結(jié)合，三者的復合物可發(fā)出熒光。本法的優(yōu)點是制備一種熒光標記的抗體，可以用于多種抗原，抗體系統(tǒng)的檢查，即可用以測定抗原，也可用來測定抗體。IFA的抗原可用蟲體或含蟲體的組織切片或涂片，經(jīng)充分干燥后低溫長期保存?zhèn)溆谩Ｒ粡堓d片可等距置放多個抗原位點用以同時檢測多個樣本或確定滴度。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）簡稱酶聯(lián)試驗，已廣泛用于多種寄生蟲感染的宿主體液以及排泄分泌物（尿，乳，糞便等）內(nèi)特異抗體或抗原微粒的檢測。根據(jù)檢測要求，試驗可分多種類型，常用者有：用于檢測抗體的間接法；檢測IgM的雙夾心法；檢測抗原的雙抗體夾心法；以固相抗體檢測抗原的競爭法以及競爭抑制法等。酶聯(lián)試驗的方法根據(jù)所用載體、酶底物系統(tǒng)、觀察反應結(jié)果等不同而有很大差別。目前最常用的固相載體為聚苯乙稀微量滴定板，具有需樣少，敏感，重演性好，使用方便等優(yōu)點。酶底物系統(tǒng)也有多種，常用的有辣根過氧化物酶一鄰苯二胺（HRP—OPD）、堿性磷酸酯酶一硝酚磷酸鹽（AKP-PNP）等，具有較好的生物放大效應。其中HRP由于價廉、易得而被廣泛應用。酶聯(lián)試驗的基本操作過程可分為：①固相包被；②溫育洗滌；③加樣；④酶結(jié)合物反應；⑤底物顯色；⑥終止反應讀取結(jié)果等若干步驟。溫育和洗滌需貫穿在每二步驟之間，用以去除多余的反應物。斑點ELISA(dot-ELISA)是近年新發(fā)展的一種ELISA技術(shù)，選用對蛋白質(zhì)有很強吸附能力的硝酸纖維素薄膜作固相載體，底物經(jīng)酶促反應后形成有色沉淀物使薄膜著色，然后目測或用光密度掃描儀定量。dot-ELISA可用來檢測抗體，也可用來檢測抗原，由于該法檢測抗原時操作較其他免疫學試驗簡便，故目前多用于抗原檢測。免疫印漬試驗是由十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE),電泳轉(zhuǎn)印及標記免疫試驗三項技術(shù)結(jié)合而成的一