濃香型白酒發(fā)酵糟中還原糖測(cè)定方法的研究

濃香型白酒發(fā)酵糟中還原糖測(cè)定方法的研究

濃香酒是一種奇怪的酒，在中國(guó)酒精飲料中占有重要地位。傳統(tǒng)濃香型白酒采用固態(tài)法釀酒,糖化和發(fā)酵在發(fā)酵糟醅中同時(shí)進(jìn)行,形成了棲息在窖池糟醅、窖泥中的龐大微生物區(qū)系在糟醅固、液、氣三相界面間的復(fù)雜物質(zhì)、能量代謝和信息傳遞過程。在這一過程中,淀粉質(zhì)釀酒原料降解和轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖(主要為還原糖)并生成乙醇,同時(shí)還生成高級(jí)醇、有機(jī)酸、酯類、醛類、酮類以及其他一些大分子物質(zhì)。因此,發(fā)酵糟醅中糖類的動(dòng)態(tài)變化不僅間接反應(yīng)窖池中乙醇的生成情況和發(fā)酵狀況,而且可以特征反映窖池中微生物的生命活動(dòng)狀況。在一般發(fā)酵工業(yè)及傳統(tǒng)釀造企業(yè),包括質(zhì)量技術(shù)檢驗(yàn)部門,測(cè)糖的經(jīng)典化學(xué)方法是斐林試劑(Fehling)法,如Lane—Eylon法和Bertrand法。該方法具有準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn),但步驟多、操作繁,對(duì)操作人員熟練程度要求較高,否則易造成較大誤差。而分光光度法不僅操作簡(jiǎn)便,與其他儀器分析方法(如HPLC法,電極電位測(cè)定法,流動(dòng)注射分析法)相比,不需高檔分析測(cè)試儀器,準(zhǔn)確度也能達(dá)到分析要求,并且能用于半微量或微量分析,近年來在糖類測(cè)定中應(yīng)用較多。但對(duì)不同的顯色原理,選定的顯色劑各不相同;而且對(duì)于同一種顯色劑,如3,5-二硝基水楊酸(簡(jiǎn)稱DNS),也會(huì)因不同測(cè)定樣品中一些物質(zhì)會(huì)對(duì)還原產(chǎn)物產(chǎn)生吸光干擾,檢測(cè)時(shí)選定的測(cè)定波長(zhǎng)也各不相同。在對(duì)白酒發(fā)酵糟醅的研究中,利用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖時(shí),如何消除白酒發(fā)酵糟醅中的干擾物質(zhì)影響,建立快速、準(zhǔn)確的測(cè)定方法,對(duì)于監(jiān)控窖池發(fā)酵糟醅發(fā)酵狀況,指導(dǎo)白酒生產(chǎn)以及進(jìn)一步研究窖池的物質(zhì)能量轉(zhuǎn)化關(guān)系具有重要的意義。1材料和方法1.1材料表面分析樣品:四川瀘州老窖酒廠發(fā)酵糟醅。1.2主要設(shè)備721型分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)酸度計(jì)(pHS-25C,上?？祪x儀器有限公司)1.3ds顯色劑的配制0.01g/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取預(yù)先在105℃烘至恒重的葡萄糖0.50g,用水溶解后移于50mL容量瓶中并稀釋至刻度。DNS顯色劑。以上試劑均為分析純。1.4實(shí)驗(yàn)方法1.4.1樣品預(yù)處理還原糖樣液:取發(fā)酵糟醅約10g加100mL蒸餾水制成懸震液,抽濾得到濾液,中和至pH6左右,定容至100mL。1.4.2最大波長(zhǎng)od測(cè)定取1mL樣液和2mLDNS顯色劑分別加入1mL水中,沸水浴5min,取出迅速冷卻,稀釋1倍,以水作參比液,分別在500～650nm波長(zhǎng)范圍測(cè)定OD值。作OD值-波長(zhǎng)曲線,選擇參比液。1.4.3波長(zhǎng)為400mn的多步參比液mL待測(cè)液于試管中,加入3,5-二硝基水楊酸4mL,同1.4.2步操作,以1.4.2步所選定的參比液,在波長(zhǎng)480nm～650nm測(cè)OD值。作OD值-波長(zhǎng)曲線,選擇最大吸收波長(zhǎng)。1.4.4最大吸收波長(zhǎng)法取待側(cè)液2mL各加入1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mLDNS顯色劑,同1.4.2步操作,以1.4.3步所選定的最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定OD值。作OD值—DNS用量關(guān)系圖,選擇顯色劑最佳用量。1.4.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參考文獻(xiàn)繪制方法,于1.4.3處所選定的波長(zhǎng)處測(cè)OD值,繪制OD值—濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。2結(jié)果與討論2.1品液預(yù)處理方法對(duì)還原糖測(cè)定結(jié)果的比較在樣品懸震、浸出時(shí),考慮到樣品中微生物菌體及酶的存在對(duì)處理過程中還原糖含量的可能影響,實(shí)驗(yàn)中比較了樣品液煮沸方法與原不煮沸方法對(duì)還原糖測(cè)定結(jié)果的差異,兩種預(yù)處理方法的比較結(jié)果如表1所示:從表1可以看出兩種方法的測(cè)定結(jié)果誤差在0.5%之內(nèi),幾乎無明顯變化。估計(jì)是由于樣品液處于較酸性(pH3.5)的環(huán)境條件下,還原糖含量難于被被微生物、酶等生化因素所影響。因而,采用本文1.4.1不煮沸的預(yù)處理方法是可行的。2.2樣品液和dna的od測(cè)定正確選擇參比溶液可以使試液的吸光度真正反映待測(cè)物的濃度。在樣品液中帶有醛基的非還原糖物質(zhì)以及含氨基的物質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果有較大影響,因此分別選擇DNS和樣品液,以水作參比在500～650nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定吸光度,結(jié)果如圖1。由圖1可以看出,樣品液和DNS的OD值均在測(cè)定范圍內(nèi)隨波長(zhǎng)增大而降低,且在590nm～650nm波長(zhǎng)范圍內(nèi),二者的OD值都很小,不會(huì)對(duì)還原產(chǎn)物的OD值造成較大的干擾。相對(duì)而言,樣品液的OD值比DNS的OD值略大一些,因而在還原糖分析測(cè)定中,可在590nm～650nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)選擇樣品液作為參比液使用。2.3顯色劑用量對(duì)sds值的影響在顯色反應(yīng)中,根據(jù)溶液平衡原理顯色劑過量愈多對(duì)反應(yīng)越有利,但是過量的顯色劑可能會(huì)在樣品液中引起副反應(yīng)。因此在樣品液濃度和其他測(cè)定條件固定的狀態(tài)下,加入不同量的DNS,在590nm～650nm波長(zhǎng)范圍內(nèi),選擇吸光度最低的600nm波長(zhǎng)測(cè)定DNS顯色劑的OD值,結(jié)果如圖2。從圖2中的曲線可見,加入的DNS在4mL以下,隨DNS用量增加,樣品反應(yīng)液的吸光度呈逐漸上升的趨勢(shì),說明參與反應(yīng)的顯色劑用量不足。當(dāng)顯色劑用量增加到4mL～6mL時(shí),測(cè)定的樣品反應(yīng)液OD值已達(dá)到最大并基本穩(wěn)定不變。因而,可以認(rèn)為,測(cè)定時(shí)2mL樣品液中加入顯色劑DNS的最佳用量是4.0mL,即樣品液于DNS顯色劑的用量比為1∶2。2.4od值在樣品的最大吸收波長(zhǎng)選取中,以樣品液作參比,取4mLDNS加入到2mL樣品液中,在570nm～650nm范圍內(nèi)測(cè)定OD值,還原糖與顯色劑反應(yīng)后在不同波長(zhǎng)下的吸光度曲線如圖3所示。在570nm～650nm波長(zhǎng)范圍內(nèi),樣品液中還原糖和DNS反應(yīng)后產(chǎn)物的OD值表現(xiàn)出較好的波形曲線,并在波長(zhǎng)610nm處有最大吸收峰,因此,發(fā)酵糟醅還原糖測(cè)定實(shí)驗(yàn)中,選取610nm作為測(cè)定用波長(zhǎng)最為合適。2.5還原糖濃度曲線的測(cè)定按1.4.5標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法,配制系列不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。以水作參比,分別取4mLDNS各加入到2mL系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中,測(cè)定OD值,作OD值-還原糖濃度曲線。結(jié)果如圖4。圖4表明:曲線的線性相關(guān)性非常好,對(duì)曲線作回歸分析得相關(guān)系數(shù)R=0.9996,回歸方程式Y(jié)=1.0412X+0.0027,其中Y表示還原糖的濃度,單位g%;X表示測(cè)定的吸光度A;0.0027表示補(bǔ)償參數(shù)。3還原糖含量的測(cè)定用3,5-二硝基水楊酸—分光光度法分析濃香型白酒發(fā)酵糟醅中的糖分含量時(shí),以樣品液作為測(cè)定的參比液,樣品液與DNS顯色劑的用量比為1∶2,在610nm處測(cè)定OD值,經(jīng)回歸方程式Y(jié)=1.0412X+0.0027可快速