大鴇oiarda遺傳多樣性研究中dna提取的應(yīng)用

大鴇oiarda遺傳多樣性研究中dna提取的應(yīng)用

隨著生物材料的發(fā)展，珍稀瀕危鳥類的遺傳、進化、種群關(guān)系、物種識別和性別鑒定等方面的研究取得了一定的成功。這些研究是基于dna水平。因此，珍稀瀕危鳥類的采樣及其dna的提取非常重要。通常取樣方法有3種,即傷害性取樣、非傷害性取樣和非損傷性取樣。目前,對家畜、家禽、試驗動物和普通動物來說,一般采取傷害性取樣或非傷害性取樣,即采用殺害動物采集需要組織或活體取一定量(一般在1mL以上)的血液;對于珍稀瀕危鳥類,傷害性取樣不現(xiàn)實,因此國內(nèi)外一直提倡后兩種取樣方法。對鳥類的非傷害性取樣通常有兩種方式:抽取血液和拔取羽毛;非損傷性取樣主要是搜集脫落的羽毛。目前,對瀕危鳥類血液DNA提取一直未見詳細的研究報道,羽毛的DNA提取多數(shù)也只限于羽髓,對羽毛其它部分的DNA提取也未見詳細的報道。另外,由于量少和取樣部位過于單一,常出現(xiàn)低純度和低含量問題。因此,一些學(xué)者提出了一些相應(yīng)的措施,例如:多管法和PCR定量法。但是這些方法不但增加了勞動力和試劑的消耗,而且需要昂貴的儀器,只有極少數(shù)的研究運用這些方法,因此沒能從根本上解決問題。總之,目前珍稀瀕危鳥類的分子生物學(xué)研究存在著取樣的局限性,為了解決這個問題,在進行大鴇(Otistarda)遺傳多樣性研究過程中,對10~70μL的血液和羽毛不同部位的DNA提取進行了細致的研究,以期拓寬珍稀瀕危鳥類的取樣范圍。1材料和方法1.1不同大蚤的靜脈取血試驗試驗動物為4只大鴇(分別采自長春、白城、內(nèi)蒙古圖牧吉和哈爾濱)、1只家雞和1只鴿子。對大鴇、家雞和鴿子進行跗靜脈取血(EDTA抗凝,全血),取血量分別為:大鴇70μL、20μL和10μL,作為對照的鴿子70μL,家雞20μL和10μL。對大鴇飛羽的羽根(0.5cm)、羽髓(1根飛羽)、羽鞘(1cm)、實心羽莖(1cm)和羽毛上臍周圍絨羽(1根飛羽)分別取樣。1.2方法1.2.1活性物質(zhì)的提取血液中DNA提取:取10~70μL的血液于1.5mL管,加入200μL的2×蔗糖-tritonX-100,使紅細胞裂解,溶液呈透亮狀態(tài)。于4000r/min下離心10min,收集沉淀,沉淀如仍帶有紅色,再用生理鹽水洗滌,直至沉淀呈無色(由于血液中的血紅素衍生物—卟啉化合物等具有抑制PCR反應(yīng)的作用,可影響PCR擴增的效果,因此必須先設(shè)法除去卟啉化合物后再提取DNA),再依次加入450μLTNE(10mmol/LTris-HCl、10mmol/LEDTA、100mmol/LNaCl,pH8.0),45μL10%SDS裂解細胞膜、核膜,10μL的蛋白酶K(10g/L,終質(zhì)量濃度為200mg/L),可見管內(nèi)的溶液呈現(xiàn)黏稠狀,特別是70μL的樣本,56℃下恒溫過夜。取出使其冷卻至室溫,用酚—氯仿萃取法提取。在70μL的樣本加入100μL的TE(10mmol/LTris-HCl、10mmol/LEDTA,pH8.0),20μL、10μL的樣本加入25μL的TE。羽毛中DNA提取:取羽毛不同部位的樣本,直接進行消化和提取,方法同上,但不需要加2×蔗糖-tritonX-100,在消化前加入10μL1mol/LDTT,以破壞二硫鍵。除了上述方法外,還對羽毛進行了Chelex-100提取法和PCR緩沖液提取法的嘗試。Chelex-100提取法:取與酚-氯仿萃取法同樣的樣品置于500μL離心管內(nèi),用無菌去離子水浸泡、清洗。用無水乙醇浸泡、清洗。吸取100μL5%Chelex-100溶液加入管中(注意吸取時應(yīng)邊吸邊劇烈搖動)。加入10μL10g/LProteinaseK并輕輕混勻,加入10μL1mol/LDTT。56℃下溫浴5h,劇烈震蕩5s,沸水浴中煮沸8min,劇烈震蕩5s,12000r/min離心2min。DNA存于上清液中,4℃保存?zhèn)溆?。PCR緩沖液提取法:取與酚—氯仿萃取法同樣的樣品置于500μL離心管內(nèi),用無菌去離子水浸泡、清洗。用無水乙醇浸泡、清洗。加入10μL10×PCRbuffer,10μL1mol/LDTT,10μL10g/LProteinaseK,用水補齊到100μL,56℃下溫浴5h,劇烈震蕩5s,沸水浴中煮沸8min,劇烈震蕩5s,12000r/min離心2min。取上清液,4℃保存?zhèn)溆谩?.2.2pcr和體外擴增血液中DNA含量和純度的測量均在蛋白質(zhì)核酸分析儀DU640(Beckman公司)上進行。羽毛DNA應(yīng)用PCR法進行檢測。由于已知血液內(nèi)含有核DNA和mtDNA,因此選一份血液DNA作為陽性對照,分別對羽毛不同部位提取的DNA進行核基因和mtDNAPCR檢測,并伴有陰性對照。反應(yīng)體系10μL,含200μmol/L的dNTP,1.5mmol/L的MgCl2,Primer各2pmol,TaqDNApolymerase0.5U(大連寶生物),血液模板50ng或羽毛1μL提取原液。核基因CHD1-Z的引物為2944F/3224R,擴增程序為:先預(yù)變性94℃3min,再94℃變性30s,52℃退火30s,72℃延伸45s,30個循環(huán),最后72℃延伸7min;mtDNA控制區(qū)Ⅱ的引物為L438/H772,擴增程序為:先預(yù)變性94℃3min,再94℃變性30s,52℃退火15s,72℃延伸20s,30個循環(huán),最后72℃延伸7min;產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠檢測。2血液和羽毛不同部位dna的pcr檢測從本試驗血液樣本中提取出的DNA的純度和濃度見表1。酚-氯仿萃提取血液和羽毛不同部位DNA的PCR檢測結(jié)果見圖1和圖2。Chelex-100提取法和PCR緩沖液提取法對羽毛不同部位DNA的提取結(jié)果基本相同,羽髓和實心羽莖兩部位獲得的DNA比酚-氯仿萃提取略多。3討論3.1紅細胞與血小板的密度由表1可知,鳥類可以從微量的血液中提取出較多的DNA,大鴇10μL的血液中最多獲得了45.75μgDNA。這在哺乳動物中是無法做到的,例如,200μL的水貂血一般只能提出2μg多的DNA。這是由于鳥類和哺乳動物的血液生理結(jié)構(gòu)不同,哺乳動物的血液中有核細胞主要是白細胞,紅細胞和血小板都不含細胞核。而鳥類除了白細胞具有細胞核外,紅細胞也有細胞核,并且鳥類沒有血小板,含有一種與血小板具有同樣功能的凝血細胞,凝血細胞也具有細胞核。據(jù)報道,人類白細胞含量為0.5~1.0萬個/mm3,而紅細胞為400~500萬個/mm3,其比例約為1∶500;在大鴇的血液中白細胞含量為(1.55±0.34)萬個/mm3,紅細胞含量為(255±3)萬個/mm3,其比例約為1∶200,凝血細胞含量為(0.40±0.28)萬個/mm3;雞的血液中白細胞含量約在1.9萬個/mm3,紅細胞含量約為210萬個/mm3。從上述數(shù)據(jù)可以看出,總體來說,哺乳動物的血細胞密度高于鳥類,但由于哺乳動物的紅細胞與血小板無核,因此,同樣體積的血液中DNA含量相差極為懸殊,鳥類甚至高出哺乳動物幾百倍。從而,鳥類可以通過微量的血液提取出較多的DNA,如,大鴇可以從10μL的血液中提出45.75μgDNA。10μL的血液約半滴血,但獲得的DNA足可以滿足各種涉及PCR反應(yīng)的分子生物學(xué)試驗。筆者認(rèn)為,取10μL的血液(約半滴血)即使對珍稀瀕危小型鳥類也不會帶來傷害,因此對于鳥類,這種非傷害性取樣可以根據(jù)需要予以推廣應(yīng)用。3.2羽階在羽髓和羽根可能含的核dna前人研究表明,羽干能夠獲得mtDNA,羽髓還可以提取核DNA。從圖1可以看出,羽毛的3個部位:羽髓、羽鞘和羽根都可以提出一定純度的核DNA,并可以理想的用于PCR反應(yīng)。對于羽鞘來說,本身可能高度角質(zhì)化,但其內(nèi)壁會附著一定量的髓質(zhì),會含有核DNA;并且在其上臍部位的鞘內(nèi)壁嵌有一個血凝塊,其中也含有一定量的核DNA,因此,對于羽鞘整體來說同樣是很好的核DNA樣本。對于羽根來說,其內(nèi)可能含有一定量的羽髓,此外,羽根還可能附帶一定量的鳥類組織。羽根含有組織細胞的多少要看羽毛的搜集方式,是撿取脫落羽毛(非損傷性取樣)還是拔取羽毛(非傷害性取樣)。拔取羽毛的羽根通常比脫落羽毛的羽根含的核DNA量要多。從圖2可以看出,羽毛的4個部位:羽髓、羽鞘、羽根和實心羽軸都提出可以用于PCR反應(yīng)的mtDNA,羽毛上臍周圍絨羽沒有提出可用mtDNA,其原因還不清楚,有待于進一步研究。在條件惡劣的野外,較難采到瀕危珍稀鳥類的完整羽毛樣本,在野外或其巢穴經(jīng)常拾到不完整的羽毛,這就要求研究者充分利用樣本,所以必須了解DNA存在而又可有效提取的部位。3.33提取dna的方法營養(yǎng)Chelex-100提取法和PCR緩沖液提取法與酚—氯仿提取法相比較,經(jīng)典的酚—氯仿法操作十分繁瑣、復(fù)雜、費時,但應(yīng)用范圍廣,且提取的DNA純度高。Chelex-100和PCR緩沖液提取法簡便快速,提取過程始終在同一試管中進行,可減少DNA的損失,這樣更加適于微量取樣樣本,由于操作步驟簡單,減少了污染機會。Chelex-100提取法對高價金屬離子有很高的親和力和鏊合作用,能夠抑制核酸酶對DNA的消化作用,防止了DNA在煮沸過程中的降解,同時在高溫、低離子強度條件下還有催化DNA釋放的作用,這樣的處理過程既達到了分離提取DNA的目的,同時也除去了一些對擴增反應(yīng)有抑制作用的因子(如重金屬離子),提高了PCR擴增的效率。PCR緩沖液提取法所用的試驗藥