山仙顆粒對(duì)黃曲霉毒素b1致大鼠肝癌模型動(dòng)物肝組織形態(tài)學(xué)及胎盤型谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的影響

山仙顆粒對(duì)黃曲霉毒素b1致大鼠肝癌模型動(dòng)物肝組織形態(tài)學(xué)及胎盤型谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的影響

*咸陽(yáng)科技計(jì)劃支持項(xiàng)目xk0614-2（3）。陜西中醫(yī)學(xué)院2005級(jí)碩士研究生山仙顆粒作為我院院內(nèi)制劑在肝癌治療中已使用將近10年,前期的實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用證明其在抑制腫瘤及提高患者生存質(zhì)量方面效果顯著,為此本研究通過復(fù)制化學(xué)誘導(dǎo)的大鼠肝癌模型,探討其對(duì)化學(xué)誘導(dǎo)性肝癌的影響作用,旨在研發(fā)高效、低毒或無毒的抗肝癌藥物。1材料和方法1.1材料1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)SD大鼠50只,體重120g～160g,雄性,由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.1.2免疫組織化學(xué)染料黃曲霉毒素B1(AFB1)、2-乙酰氨基芴(2-AAF)均為美國(guó)ACROS公司產(chǎn)品,二甲基亞砜(DMSO)為美國(guó)Amresco公司產(chǎn)品;GSTpi多克隆抗體(RabbitAnti-GSTpi),工作濃度1∶80,即用型SABC免疫組化染色試劑盒,DAB顯色試劑盒,均由武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn);山仙顆粒(由西洋參、莪術(shù)、山楂、仙鶴草等組成):由陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院制劑中心提供,批號(hào):20051104。替加氟片(FT-207):上海醫(yī)藥(集團(tuán))有限公司華聯(lián)制藥廠生產(chǎn),批號(hào):060603。1.2方法和步驟1.2.1動(dòng)物模型采用段小嫻等建立的單劑量黃曲霉毒素B1(AFB1)致大鼠肝癌短期實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?AFB1+2-AAF+2/3PH)。1.2.2山仙顆粒的灌胃協(xié)同模型采用完全隨機(jī)分組法,每組10只,分別為:空白組(A組):正常飼養(yǎng),不做任何處理。模型組(B組):采用“AFB1+2AAF+肝2/3切除”的肝癌模型,在此期間每日生理鹽水灌胃一次。大劑量山仙顆粒組(C組):造模同上,每日按山仙顆粒10g/kg配制藥液灌胃一次。小劑量山仙顆粒組(D組):造模同上,每日按山仙顆粒2.5g/kg配制藥液灌胃一次。對(duì)照組(E組):造模同上,每日按替加氟200mg/kg配制藥液灌胃一次。每籠五只分籠飼養(yǎng)。1.2.3免疫組化染色所有動(dòng)物每周定期稱體重一次,并隨時(shí)觀察進(jìn)食情況、中毒癥狀及死亡情況。于實(shí)驗(yàn)第6周末各組動(dòng)物稱重后在10%水合氯醛(400mg/kg)麻醉下剖腹取出肝臟,于10%(體積分?jǐn)?shù))福爾馬林溶液中固定24h,脫水、透明、浸蠟,常規(guī)石蠟包埋,行5μm及4μm厚連續(xù)切片,分別行HE染色和免疫組化染色。肝組織形態(tài)學(xué)檢查以1987年全國(guó)實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤病理專題座談會(huì)紀(jì)要所制定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。肝組織胎盤型谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST-P)免疫組化染色,以石蠟切片采用SABC法進(jìn)行,以PBS代替Ⅰ抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定采用形態(tài)學(xué)分析軟件JD-801D對(duì)GST-P陽(yáng)性灶定量分析,即測(cè)量單位面積內(nèi)陽(yáng)性灶的個(gè)數(shù)(個(gè)/cm2)及單位面積內(nèi)陽(yáng)性灶的面積(mm2/cm2)。1.2.4統(tǒng)計(jì)分析各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,所有數(shù)據(jù)用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。2結(jié)果2.1對(duì)2-aaf飼料一般情況的影響A組動(dòng)物一般狀況良好,活動(dòng)正常。造模各組動(dòng)物一般情況較差,在給AFB1后各組動(dòng)物均有精神差,食量減少現(xiàn)象,給2-AAF飼料期間,各組動(dòng)物均有輕度厭食、食量減少現(xiàn)象,其中B組與D組較明顯,體重增長(zhǎng)減慢。C組、D組一般狀況較好,體重增長(zhǎng)較B組及E組快,其中以C組最明顯。實(shí)驗(yàn)過程中B組2只、E組1只死于肝大部分切除術(shù)(PH)術(shù)中出血,D組1只PH后未蘇醒,死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),造模各組個(gè)別動(dòng)物處死時(shí)有腹水及腸梗阻現(xiàn)象。2.2各組大鼠肝臟功能指標(biāo)的比較表1A組個(gè)別輕度充血,余無異常。鏡下所見:個(gè)別動(dòng)物僅見部分肝竇充血。B組肝臟腫脹增大,表面不光滑,表面及切面可見較多散在直徑2～4mm不等的灰白色結(jié)節(jié),略隆起。鏡下所見:肝小葉結(jié)構(gòu)受到破壞,肝細(xì)胞渾濁腫脹,有水樣變性及點(diǎn)狀壞死,可見核空泡和胞腔空泡,肝竇內(nèi)見卵圓細(xì)胞增生,個(gè)別區(qū)域間質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn);部分動(dòng)物肝細(xì)胞變性壞死劇烈,出現(xiàn)嗜酸性、嗜堿性、透明細(xì)胞灶、混合肝細(xì)胞灶及大小不一的增生結(jié)節(jié),結(jié)節(jié)外肝細(xì)胞索消失,細(xì)胞排列紊亂、擁擠,可見大量梭形、圓形、卵圓細(xì)胞增生,匯管區(qū)小膽管增生,可見少量雙核、核深染、巨核細(xì)胞。C組肝臟表面欠光澤,所有動(dòng)物均未見明顯肝臟腫脹,表面無或少見結(jié)節(jié),腹腔內(nèi)也未見滲出液。鏡下所見:性質(zhì)上與B組相似,但肝細(xì)胞的變性、壞死及卵圓細(xì)胞增生均顯著減輕;嗜酸、嗜堿、透明及混合細(xì)胞灶顯著減少;無增生結(jié)節(jié)出現(xiàn)。D組肝臟略腫脹,表面欠光澤,表面及切面可見散在直徑1～4mm不等的灰白色結(jié)節(jié),微隆起。鏡下所見:性質(zhì)上與B組相似,肝小葉結(jié)構(gòu)亦不同程度受到破壞,肝細(xì)胞的變性、壞死及卵圓細(xì)胞增生略輕,可見核空泡和胞腔空泡,部分可見嗜酸、嗜堿、透明及混合細(xì)胞灶,可見增生結(jié)節(jié)。E組肝臟外觀與D組類似。鏡下所見:性質(zhì)上亦與B組相似,肝細(xì)胞的變性、壞死及卵圓細(xì)胞增生均較輕;嗜酸、嗜堿、透明及混合細(xì)胞灶減少;個(gè)別可見增生結(jié)節(jié)。2.3兩組積mm2/cm2的比較C組動(dòng)物肝組織單位面積內(nèi)胎盤型谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST-P)灶個(gè)數(shù)(個(gè)/cm2)及灶面積(mm2/cm2)均明顯較B組少(小),差異具有顯著性(P均<0.01);D組及E組動(dòng)物肝組織單位面積內(nèi)胎盤型谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST-P)灶個(gè)數(shù)(個(gè)/cm2)及灶面積(mm2/cm2)雖均較B組少(小),但差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05,見附表。3山仙顆粒對(duì)大鼠肝胰腺組織的復(fù)制及其限制黃曲霉毒素B1是劇毒物質(zhì),其致癌強(qiáng)度比奶油黃大900倍,比二甲基亞硝胺高75倍,可誘發(fā)所有動(dòng)物發(fā)生肝癌。本研究B組觀察到明顯的肝細(xì)胞變性壞死、增生灶(嗜酸性、嗜堿性、透明、混合肝細(xì)胞)、大小不一的肝細(xì)胞增生結(jié)節(jié)及病理性核分裂相等特異性的肝細(xì)胞癌前病變,與實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤病理標(biāo)準(zhǔn)基本相符,成功地復(fù)制了化學(xué)誘導(dǎo)的大鼠肝癌模型。C組在癌癥發(fā)生、發(fā)展過程中,與B組相比肝細(xì)胞的變性、壞死及增生均明顯減輕,特異性細(xì)胞增生明顯減少,未見明顯病理性核分裂相及增生結(jié)節(jié)。GST-π(在鼠為P)為一組二聚體蛋白,是谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的一種同工酶,屬胚胎型同工酶,廣泛分布于人體組織,與體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化作用及腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切。其在正常肝細(xì)胞中不表達(dá),而在早期肝癌、肝癌前病變、不典型增生及原發(fā)性肝癌中高度表達(dá),大量資料表明,GST-π(在鼠為P)在肝癌前病變組織及肝癌組織中表達(dá)明顯增高,免疫組化染色可在肝臟病變發(fā)生早期檢測(cè)到由GST-π(在鼠為P)陽(yáng)性細(xì)胞構(gòu)成的微小病灶,