還原型和氧化型谷胱甘肽在磁性Fe

還原型和氧化型谷胱甘肽在磁性Fe

谷岡甘醇是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸結(jié)合的三醇。半胱氨酸基是其活性物質(zhì)，但基很容易引起兩個(gè)歐岡甘醇的偶聯(lián)。因此，谷岡甘醇有兩種形式：還原型（gsh）和氧化型（gssg）（如圖1所示）。在生理?xiàng)l件下，大多數(shù)谷岡甘醇是還原型的。谷岡甘醇還原酶可以激活兩種形式之間的交換。谷胱甘肽具有多種重要的作用,如抗病毒作用、抗腫瘤作用、保護(hù)肝臟作用等。磁性無(wú)機(jī)納米粒子(如γ＿Fe2O3、Fe3O4等)既有常見無(wú)機(jī)納米粒子的物理化學(xué)特性,又有磁性,在醫(yī)療醫(yī)藥、生物化學(xué)及工業(yè)應(yīng)用等領(lǐng)域顯示出廣泛的應(yīng)用前景,成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。最近,將特異性強(qiáng)的導(dǎo)向肽(由10～20個(gè)氨基酸組成)與納米顆粒相結(jié)合以開發(fā)其在腫瘤診斷、治療及靶向給藥中應(yīng)用的研究受到重視。Akerman等研究了對(duì)肺癌具有特異性的導(dǎo)向肽與ZnS包覆的CdSe納米顆粒相偶聯(lián)的復(fù)合體在動(dòng)物體內(nèi)的定向,其結(jié)果表明導(dǎo)向肽與納米顆粒的結(jié)合將在疾病的診斷、治療及靶向給藥方面有廣泛的應(yīng)用前景。將導(dǎo)向肽與磁性納米顆粒相結(jié)合,能發(fā)揮雙導(dǎo)向(磁導(dǎo)向和生物導(dǎo)向)的功能。因此,研究肽在磁性納米顆粒上的結(jié)合組裝有很大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。但由于十幾個(gè)氨基酸組成的肽,其化學(xué)合成步驟繁瑣、制備過(guò)程要求苛刻、價(jià)格高,為此筆者選擇了一種常見、普遍而在生物學(xué)上又有重要應(yīng)用和研究?jī)r(jià)值的小分子肽———谷胱甘肽作為替代物進(jìn)行研究。研究谷胱甘肽在磁性粒子上的吸附組裝的行為,對(duì)了解由更多氨基酸組成的具有導(dǎo)向功能的肽在磁性粒子上的吸附組裝行為有重要的指導(dǎo)意義。本文通過(guò)化學(xué)共沉淀法合成了磁性載體———納米Fe3O4,研究了谷胱甘肽在Fe3O4磁性粒子上的直接吸附組裝行為及相關(guān)熱力學(xué)函數(shù),并進(jìn)行了表征,考察了修飾活化試劑二環(huán)己基碳化二亞胺和pH對(duì)吸附組裝的影響,簡(jiǎn)單討論了吸附的機(jī)理。1實(shí)驗(yàn)部分1.1實(shí)驗(yàn)試劑和試劑UnicoUV＿2802S型紫外可見分光光度計(jì)(尤尼柯(上海)儀器有限公司);PHS＿2C型酸度計(jì)(上海偉業(yè)儀器廠);THZ＿恒溫振蕩器(江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠);F＿GZX101＿1BSⅡ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司);氧化型谷胱甘肽、還原型谷胱甘肽(上海藍(lán)生科技發(fā)展有限公司);2,9＿二甲基＿1,10-菲啉(簡(jiǎn)稱新銅試劑,中國(guó)上海三愛思試劑公司);二環(huán)己基碳化二亞胺(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);磷酸、乙醇、磷酸氫二鈉、檸檬酸(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)均為分析純。1.2酶法分離Fe3O4采用共沉淀法制得,即在25℃、氮?dú)獗Ｗo(hù)和快速磁攪拌的條件下向亞鐵鹽和鐵鹽混合溶液中滴加0.1molL的氫氧化鈉溶液,直至pH為11,繼續(xù)攪拌2h,在80℃下陳化2h,經(jīng)洗滌和磁分離直至中性,過(guò)濾抽干后在真空干燥箱內(nèi)80℃干燥24h,研磨備用。1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制谷胱甘肽測(cè)定采用紫外分光光度法,在新銅試劑＿谷胱甘肽＿乙醇體系中進(jìn)行顯色反應(yīng)后測(cè)定。先準(zhǔn)確稱取0.1gGSH,以水溶解至1000mL得到0.1mgmL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。稱取62.5mgCuSO4·5H2O,以20～30mL水溶解,再稱取135.8mg新銅試劑,用8mL無(wú)水乙醇溶解,二者充分混合后以水定容至250mL,作為顯色劑。于25mL容量瓶中,加入適量的谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液、3mL顯色劑和7mL無(wú)水乙醇,搖勻,以水定容,穩(wěn)定30min。用1cm比色皿,以試劑空白作參比,于456nm處測(cè)定試劑吸光度值,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。氧化型谷胱甘肽測(cè)試時(shí)加入0.1gFeSO4·7H2O,將其還原成GSH后按照還原型谷胱甘肽的測(cè)試方法測(cè)試。1.4吸附量的確定在一系列50mL磨口錐形瓶中分別加入50mgFe3O4和25mL不同濃度的谷胱甘肽溶液,分別在20、40、60℃溫度下以220rmin的轉(zhuǎn)速振蕩24h(事先吸附平衡實(shí)驗(yàn)證實(shí)24h已達(dá)到充分的平衡,谷胱甘肽濃度不再發(fā)生變化),過(guò)濾,按照上述方法處理后用紫外分光光度計(jì)在456nm處測(cè)定試劑的吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出吸附后溶液的平衡濃度,由以下公式計(jì)算出Fe3O4對(duì)還原性和氧化型谷胱甘肽的吸附量。吸附量計(jì)算公式為:式中q為吸附量(mgg),V為被吸附溶液的體積(L),C0為吸附前的溶液濃度(mgL),Ce為平衡濃度(mgL),m為Fe3O4的用量(g)。1.5活性炭-碳氧基亞胺對(duì)谷胱甘肽吸附量的影響在一系列50mL磨口錐形瓶中加入50mgFe3O4和25mL濃度1mgmL的還原性或氧化型谷胱甘肽,再加入不同質(zhì)量的碳化二亞胺配制成碳化二亞胺含量不同的混合溶液,然后一同置于恒溫振蕩器中,在20℃下以220rmin的轉(zhuǎn)速振蕩24h至平衡,測(cè)定各自的吸附平衡濃度,計(jì)算相應(yīng)的吸附量,作圖分析碳化二亞胺含量對(duì)谷胱甘肽吸附的影響。1.6kno3-ro3o4溶液的制備為了研究谷胱甘肽的吸附性質(zhì)和規(guī)律,進(jìn)行了脫附實(shí)驗(yàn)。在50mL磨口錐形瓶中預(yù)先加入吸附谷胱甘肽后的Fe3O4粉體125mg,加入25mL0.1molL的KNO3溶液,振蕩2h,過(guò)濾,再回收濾紙上的Fe3O4至50mL磨口錐形瓶中,再加入25mL0.1molL的KNO3溶液,振蕩2h后過(guò)濾,再同樣在回收的Fe3O4中加入25mL0.05molL的HCl,振蕩2h后過(guò)濾。上述所有振蕩都在轉(zhuǎn)速220r/min、溫度20℃下進(jìn)行。分析各次濾液中谷胱甘肽的濃度,計(jì)算各次相應(yīng)洗脫量。2結(jié)果與討論2.1納米粒子的制備圖2為Fe3O4納米微粒的TEM照片,從照片中可看出,由化學(xué)共沉淀方法制備的Fe3O4納米微粒主要為球形結(jié)構(gòu),小部分粒子近似呈立方體形,粒子的直徑在7～18nm之間,平均直徑約為11nm。BET測(cè)試得到的粒子的比表面積為116.1m2g,計(jì)算得到的平均粒徑為11.6nm,與TEM數(shù)據(jù)相當(dāng)。2.2還原型和氧化型谷胱甘肽的吸附行為不同溫度下Fe3O4吸附還原型和氧化型谷胱甘肽的等溫線(經(jīng)測(cè)定pH分別為6.79、6.63)如圖3和圖4所示。由圖可見,Fe3O4對(duì)谷胱甘肽的吸附均隨溫度的升高吸附量減小,表明Fe3O4對(duì)還原型和氧化型谷胱甘肽的吸附是放熱過(guò)程,溫度低時(shí)有利于谷胱甘肽的吸附。圖5給出了在相同溫度293K、相同初始濃度條件下還原型和氧化型谷胱甘肽的吸附等溫線。由圖可見,兩者吸附曲線的形狀很相像,都是隨濃度的增加吸附量增大,增加到一定濃度時(shí)吸附達(dá)到飽和,還原型和氧化型谷胱甘肽飽和吸附量分別為69.96mgg和79.67mgg,可見Fe3O4對(duì)氧化型谷胱甘肽的的吸附量大于還原型谷胱甘肽。還原型和氧化型谷胱甘肽結(jié)構(gòu)(如圖1所示)相差很大,氧化型谷胱甘肽分子是由兩條還原型谷胱甘肽分子鏈偶聯(lián)而成。谷胱甘肽分子能夠和Fe3O4納米粒子發(fā)生吸附作用,主要依賴谷胱甘肽分子的羧基和Fe3O4粒子表面羥基之間的靜電和氫鍵以及部分化學(xué)成鍵作用,每個(gè)氧化型谷胱甘肽分子的上的羧基個(gè)數(shù)比還原型谷胱甘肽分子上的多,因此在相同情況下,Fe3O4納米粒子和氧化型谷胱甘肽分子間作用力比較大,Fe3O4磁性納米粒子表面吸附達(dá)到飽和時(shí),它對(duì)氧化型谷胱甘肽的吸附量就大于對(duì)還原型谷胱甘肽的吸附量。從圖6可以看出,當(dāng)溶液中碳化二亞胺含量小于0.5mgmL時(shí),還原型和氧化型谷胱甘肽在粒子上的吸附量隨著碳化二亞胺濃度的增加迅速增加,但當(dāng)溶液中碳化二亞胺含量大于0.5mgmL時(shí),隨著碳化二亞胺濃度的增加,吸附量幾乎沒有變化。碳化二亞胺在反應(yīng)過(guò)程中起到修飾谷胱甘肽上的羧基的作用,使它活化而能更容易和Fe3O4粒子上的羥基發(fā)生反應(yīng)而被固定在粒子表面上。碳化二亞胺開始起到的作用很大,但隨加入量的增加,達(dá)到0.5mgmL時(shí),吸附量不再增加,可能此時(shí)谷胱甘肽在粒子上的吸附已到達(dá)飽和,Fe3O4粒子表面的活性位點(diǎn)已被占滿,而繼續(xù)增加碳化二亞胺的濃度不能使吸附量再增大。因此碳化二亞胺的最佳加入量為0.5mgmL。圖7和圖8給出了在相同溫度293K、相同初始濃度(1mgmL)條件下還原型和氧化型谷胱甘肽在不同pH時(shí)的吸附曲線。由圖可見,兩者吸附曲線的形狀很相似,pH在2.8～6.0范圍內(nèi)時(shí)吸附量較大,且變化不大;pH大于7時(shí),吸附量下降很快。根據(jù)電離常數(shù),計(jì)算得到還原型和氧化型谷胱甘肽的等電點(diǎn)分別為2.27和2.19,而測(cè)定得到Fe3O4的等電點(diǎn)為6.53。因此在pH2.8～6范圍內(nèi)時(shí),還原型和氧化型谷胱甘肽都帶負(fù)電,而Fe3O4表面帶正電,Fe3O4對(duì)還原型和氧化型谷胱甘肽有較強(qiáng)的靜電作用,此時(shí)可發(fā)生電性吸附,吸附量變大;在pH大于7時(shí),還原型和氧化型谷胱甘肽及Fe3O4表面都帶負(fù)電,且pH越大,帶負(fù)電越多,兩者間的電性排斥力也越強(qiáng),此時(shí)不可能發(fā)生靜電吸附,因此吸附量變小。但此情況下還是有一定的吸附量,證明除了靜電吸附作用外,還有其它的吸附作用。根據(jù)Freundlich等溫方程:式中:qe為平衡吸附量(mgg);Ce為吸附平衡濃度(mgL);KF、n為常數(shù),KF可用來(lái)衡量吸附能力的相對(duì)大小。用Freundlich吸附等溫式對(duì)以上圖中數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,結(jié)果見表1。在表1中,Freundlich公式擬合的相關(guān)系數(shù)r都達(dá)到0.99,說(shuō)明Freundlich公式能很好地適用于所研究的體系。在Freundlich公式中,KF可用于表示吸附能力的相對(duì)大小,常數(shù)n與吸附推動(dòng)力的強(qiáng)弱有關(guān),KF值越大,吸附能力越大;n值越大,吸附強(qiáng)度越大。不同溫度下,Fe3O4對(duì)還原型和氧化型谷胱甘肽的吸附隨著溫度的升高,KF值下降,表明降低溫度有利于吸附;常數(shù)n也隨著溫度的升高而降低,也表明吸附強(qiáng)度隨著溫度的升高而降低。因此,為增加Fe3O4對(duì)還原型和氧化型谷胱甘肽的吸附量和提高吸附強(qiáng)度應(yīng)該選擇在較低的溫度下進(jìn)行。2.3氧化型谷胱甘肽的吸附能力和g的變化吸附量規(guī)律可以通過(guò)熱力學(xué)函數(shù)ΔG、ΔH、ΔS的數(shù)值來(lái)解釋,根據(jù)文獻(xiàn)和可得出熱力學(xué)函數(shù)計(jì)算式:Ce是吸附質(zhì)的平衡濃度,K0是常數(shù),n是Freundlich方程中的常數(shù)。根據(jù)吸附實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算所得到的ΔH、ΔG、ΔS值列于表2中。由表2可見,Fe3O4對(duì)還原型和氧化型谷胱甘肽的吸附均是自發(fā)的放熱過(guò)程(ΔG<0,ΔH<0),并且氧化型谷胱甘肽ΔG的絕對(duì)值大于還原型谷胱甘肽ΔG的絕對(duì)值,表明Fe3O4對(duì)氧化型谷胱甘肽的吸附有更大的推動(dòng)力,這與表1KF值所表示的吸附能力順序相一致。之所以Fe3O4對(duì)氧化型谷胱甘肽的吸附比較容易,是因?yàn)檠趸凸入赘孰纳嫌兴膫€(gè)游離的羧基,而還原型谷胱甘肽上只有兩個(gè)游離的羧基,羧基越多,和Fe3O4表面發(fā)生靜電和氫鍵吸引作用也越強(qiáng),吸附也越牢固和容易。還原型和氧化型谷胱甘肽的吸附焓變?chǔ)<0,表明吸附為放熱過(guò)程,降低溫度有利于吸附。ΔH<0、ΔS<0,表明其吸附為焓驅(qū)動(dòng)的放熱熵減過(guò)程。另外,ΔG反映了一個(gè)反應(yīng)推動(dòng)力的大小,ΔG越負(fù),表明推動(dòng)力越大,在吸附過(guò)程中體現(xiàn)出來(lái)就是吸附量也越大。表2中還原型和氧化型谷胱甘肽在磁性納米粒子上的ΔG都為負(fù)值,絕對(duì)值隨著溫度的上升而下降,且還原型谷胱甘肽ΔG絕對(duì)值小于氧化型谷胱甘肽ΔG絕對(duì)值?？梢詮纳鲜鰺崃W(xué)數(shù)據(jù)推出還原型和氧化型谷胱甘肽吸附量均隨著溫度的上升而下降,且氧化型谷胱甘肽吸附量大于還原性谷胱甘肽吸附量的結(jié)論,這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果是相一致的。2.4還原型和氧化型谷胱甘肽的脫附脫附實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果如表3所示。從表3可以看出,在用0.1molLKNO3浸泡4h后,還原型和氧化型谷胱甘肽只有很少量從Fe3O4表面洗脫,再用0.05molLHCl浸泡2h后,在濾液中也只檢出少量還原型和氧化型谷胱甘肽,在先后用0.1molLKNO3和0.05molLHCl脫附后,也各自總共只有16%的還原型和氧化型谷胱甘肽被脫附,絕大部分原先吸附在Fe3O4上的還原型和氧化型谷胱甘肽仍然牢固的吸附著。從以上分析可知,還原型和氧化型谷胱甘肽在Fe3O4表面上的吸附是不可逆的,吸附后較難脫附。脫附實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)把吸附谷胱甘肽后的Fe3O4粉體加入到強(qiáng)電解質(zhì)KNO3溶液中,K+和NO3-使得谷胱甘肽離子和Fe3O4納米粒子間的氫鍵和靜電吸引作用被破壞,應(yīng)能使谷胱甘肽從Fe3O4表面脫附,而事實(shí)上電解質(zhì)KNO3對(duì)吸附在Fe3O4表面的谷胱甘肽基本不起作用,谷胱甘肽仍能夠大量吸附在粒子表面上,說(shuō)明谷胱甘肽和Fe3O4粒子表面羥基可能形成了部分共價(jià)鍵,但仍有部分是憑借物理作用。另外,鹽酸的加入也同樣不能將它脫附,進(jìn)一步說(shuō)明形成的部分共價(jià)鍵穩(wěn)定性特別好。Aria等所作的半胱氨酸對(duì)氫氧化鐵的分解還原動(dòng)力學(xué)和機(jī)理研究中已證實(shí)了鐵離子可以和帶巰基的物質(zhì)形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵結(jié)構(gòu)。2.5納米粒子和塊體材料的磁化強(qiáng)度圖9為吸附前后樣品室溫下所測(cè)的磁化曲線,從圖上可知Fe3O4和吸附還原型或氧化型谷胱甘肽后的Fe3O4粉體均為超順磁性粒子,其比飽和磁化強(qiáng)度Ms分別為66.80emug、55.28emug和52.17emug。相對(duì)于塊體材料(飽和磁化度為92emug),Fe3O4納米粒子的比飽和磁化強(qiáng)度Ms下降了30%,這主要是納米粒子的量子尺寸效應(yīng)所致,在納米尺度內(nèi),粒子的直徑減小,比飽和磁化強(qiáng)度亦相應(yīng)降低。吸附還原型和氧化型谷胱甘肽后的Ms有所下降,一方面可能是谷胱甘肽包覆在磁性粒子的表面,抑制了其磁運(yùn)動(dòng);另一方面,由于吸附有一定量的谷胱甘肽導(dǎo)致了Ms下降。3修飾偶聯(lián)劑與還原型和氧化型谷胱甘肽的反應(yīng)還原型和氧化型谷胱