流式細(xì)胞儀分離精子技術(shù)在性別控制中的應(yīng)用

流式細(xì)胞儀分離精子技術(shù)在性別控制中的應(yīng)用

1分離精子技術(shù)的應(yīng)用人類自古以來就意識(shí)到性別控制帶來的重要性。對(duì)于人類,如果能根據(jù)意愿選擇后代的性別,其最重要的意義在于避免患上與性別相關(guān)的疾病;而目前已知的X染色體連鎖遺傳疾病就有370多種,如色盲、肌營(yíng)養(yǎng)不良、血友病等。在畜牧業(yè)生產(chǎn)中,有選擇地繁殖出具有預(yù)知性別的畜禽后代,將能使產(chǎn)肉、產(chǎn)奶、產(chǎn)毛等與性別相關(guān)生產(chǎn)性能的經(jīng)濟(jì)效益在畜群后代中獲得大大提高,加快畜牧業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展。分離精子技術(shù)是有效的性別控制方法。如果在受精之前能將X精子和Y精子分離,再通過與人工授精、體外受精和胚胎移植等動(dòng)物繁殖新技術(shù)相結(jié)合,就能得到預(yù)知性別的動(dòng)物后代。自1925年Lush首次嘗試分離兔子精子以來,許許多多的科學(xué)工作者對(duì)分離精子的研究做了不懈的努力,依據(jù)精子的密度、形態(tài)、大小、活力、表面電荷和免疫原性等特性發(fā)明了各種分離精子的方法,試圖將X精子和Y精子分離開。任何一種分離精子方法,至少應(yīng)滿足以下三個(gè)條件方可認(rèn)為成功:一,所獲得的X精子或Y精子具有較大的數(shù)量,并能重復(fù)得到相似的結(jié)果;二,所得到的精子能夠與卵母細(xì)胞進(jìn)行正常的受精;三,用分離后的精子生產(chǎn)的胚胎或動(dòng)物后代的性別必須與期望值相符合。直至目前,只有以X精子和Y精子的DNA含量差別為基礎(chǔ)的流式細(xì)胞儀分離精子法能完全符合這些條件,也就是說,該方法是現(xiàn)今最成功而有效的分離精子方法。下面內(nèi)容是對(duì)流式細(xì)胞儀分離精子法的發(fā)展歷史、分離原理及其存在問題和應(yīng)用前景進(jìn)行概述。2精子的分離與利用1910年,Guyer首次發(fā)現(xiàn)了性染色體。1925年,Lush第一個(gè)試圖根據(jù)X精子和Y精子密度差異的原理,采用離心分離法分離兔子的精子,但所獲得的后代與對(duì)照組沒有顯著差別。20世紀(jì)60年代流式細(xì)胞儀誕生,激發(fā)了人們測(cè)定單個(gè)細(xì)胞的DNA進(jìn)行各項(xiàng)研究的興趣,而利用精子染色體DNA作為一種標(biāo)記來分離哺乳動(dòng)物XY精子的研究也從此逐漸展開。這期間,許多學(xué)者投入到了精子形狀對(duì)激發(fā)熒光信號(hào)的影響、精子DNA染料的選擇以及流式細(xì)胞儀的改進(jìn)等方面的研究中。1989年,Johnson等用流式細(xì)胞儀成功地分離兔子活的X和Y精子,并通過人工授精得到兔子后代,雄性準(zhǔn)確率為81%,雌性準(zhǔn)確率為94%,所有的兔仔在形態(tài)以及生育能力上都沒有因?yàn)榉蛛x精子的處理過程而受到顯著影響。這一研究成果第一次向人們展示了一種科學(xué)、準(zhǔn)確、高效地分離精子性別控制技術(shù)。1993年,英國(guó)劍橋動(dòng)物生物有限公司開展分離牛精子體外受精研究并獲得成功。他們將獲得的預(yù)選性別胚胎移植到9頭受體母牛,其中4頭懷孕并分別產(chǎn)下3頭母犢牛和3頭公犢牛,其性別準(zhǔn)確率均達(dá)到100%。在1997年至1999年間,美國(guó)人Seidel等共做了11組分離公牛精子人工授精試驗(yàn);結(jié)果顯示,除了冷凍分離精子授精后的懷孕率為對(duì)照組的80%左右以外,所獲得的懷孕率、產(chǎn)犢情況、初生體重以及隨后的生長(zhǎng)發(fā)育與對(duì)照組的結(jié)果沒有顯著差別,至今還沒有發(fā)現(xiàn)任何異?，F(xiàn)象,用X精子授精后所產(chǎn)下犢牛的性別準(zhǔn)確率為83%,Y精子為90%。目前,分離精子性別控制技術(shù)已經(jīng)在牛馬等部分具有優(yōu)良遺傳品質(zhì)的家畜上開始了大規(guī)模的商業(yè)化推廣,分離精子人工授精在世界范圍內(nèi)至少得到了2萬(wàn)頭以上的牛犢。在人方面,為避免X染色體連鎖的遺傳疾病以及平衡家庭性別等需要,美國(guó)弗吉尼亞州的遺傳與體外受精研究所1998年就利用分離后的精子進(jìn)行子宮內(nèi)授精、體外受精和單精子顯微受精的臨床研究;結(jié)果顯示,女嬰的性別準(zhǔn)確率達(dá)到了88%。此外,分離精子性別控制研究還在諸如羊、豬等哺乳動(dòng)物以上相續(xù)獲得成功。目前,流式細(xì)胞儀分離精子的速度與上世紀(jì)90年代初期相比已提高了30多倍,分離X精子純度在85%～90%時(shí)速度可以達(dá)到11×106個(gè)/小時(shí)以上;分離精子冷凍保存技術(shù)不斷提高,液氮冷凍保存解凍后,90%以上的精液樣本的活率已經(jīng)提高到了0.35以上;與之相關(guān)的人工授精、體外受精等技術(shù)正不斷完善?？梢钥隙?流式細(xì)胞儀分離精子技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為一種科學(xué)、可靠、高效的哺乳動(dòng)物性別控制方法。3流式細(xì)胞儀分離精子的原理3.1x精子和y精子在小鼠體內(nèi)的表達(dá)在哺乳動(dòng)物中,決定動(dòng)物性別的關(guān)鍵是其所攜帶不同的性染色體。例如正常雙倍體黃?？偣灿?0條染色體,其中公牛為58條常染色體,1條X染色體,1條Y染色體;而母牛為58條常染色體,2條X染色體。當(dāng)經(jīng)過減數(shù)分裂形成單倍體的配子后,X精子攜帶X染色體,它與卵子受精后產(chǎn)生雌性后代;Y精子攜帶Y染色體,它與卵子受精后產(chǎn)生雄性后代。在哺乳動(dòng)物(家畜)中,通常X精子的DNA含量比Y精子多3.0%～4.5%。各種動(dòng)物X精子和Y精子DNA差別見表1。3.2透活細(xì)胞的脂質(zhì)膜Hoechst33342是一種相對(duì)安全的活細(xì)胞熒光染料,分子式為C27H28N6O·3HCL,分子量為561.9。它能穿透活細(xì)胞的脂質(zhì)膜,以非嵌入(Non-intercalate)方式特異地到結(jié)合到DNA雙鏈小溝的腺嘌呤和胸腺嘧啶密集區(qū)域,即主要通過氫鍵、范德華力和電場(chǎng)相互作用力與DNA結(jié)合。精子上的Hoechst33342在激光的照射下,能定量地激發(fā)出熒光。該染料的特殊性在于不僅能滲透進(jìn)入活精子膜,而且在適當(dāng)濃度時(shí)對(duì)精子活力、受精后的胚胎和動(dòng)物后代的發(fā)育都沒有造成顯著影響。3.3流式細(xì)胞儀定向的準(zhǔn)確性分離精子時(shí)Hoechst33342的染色方法,通常先將精子稀釋到1.5億/毫升,加入Hoechst33342至40微克/毫升,在35℃水浴中染色60分鐘。染色后精子通過流式細(xì)胞儀時(shí),在細(xì)微的進(jìn)樣管液流中排成單列,高速射出噴嘴后逐個(gè)與激光交截。精子上的熒光染料Hoechst33342被氬離子紫外激光(～350nm)激發(fā),產(chǎn)生藍(lán)色激發(fā)光(～460nm)。由于X精子所含有DNA比Y精子多,結(jié)合上比較多的Hoechst33342,所激發(fā)出的熒光就比Y精子強(qiáng)(圖1)。流式細(xì)胞儀根據(jù)熒光強(qiáng)度的差別分辨出哪個(gè)是X精子,哪個(gè)是Y精子。同時(shí),由于噴嘴產(chǎn)生高頻率震動(dòng),高速噴射出的液流形成了包含單個(gè)X精子或者Y精子的微小液滴。當(dāng)液滴被充上正電荷或者負(fù)電荷后,在電場(chǎng)力的引導(dǎo)下,分別落入不同的收集容器中,X精子和Y精子得以分離。分離精子準(zhǔn)確率和速度的關(guān)鍵在于精子通過流式細(xì)胞儀接受激光照射時(shí)姿態(tài)的一致性,即定向效率。由于哺乳動(dòng)物的精子形狀不對(duì)稱,激光從不同的角度照射激發(fā)熒光量存在差異。若精子通過流式細(xì)胞儀過程中定向不一致時(shí),X精子和Y精子之間DNA含量微小的差別被掩蓋,探測(cè)器收集到的熒光信號(hào)就沒有顯著差異。簡(jiǎn)而言之,分離時(shí)只對(duì)那些扁平面整齊地向著前相角熒光探測(cè)器的精子進(jìn)行分離,其余均被拋棄。普通的流式細(xì)胞儀的定向是隨機(jī)的,當(dāng)包含精子的液流從噴嘴射出時(shí),只有大約10%的精子定向正確。目前,效率最高精子定向系統(tǒng)是由Rens等發(fā)明制作的橢圓內(nèi)腔噴嘴,其精子定向效率可達(dá)70%,能正確辨別并分離的精子數(shù)目大大提高。這一發(fā)明成果后來由美國(guó)的XY公司獲得,再經(jīng)過改進(jìn)后制成陶瓷噴嘴,安裝在高速流式細(xì)胞儀MoFloSX中,實(shí)現(xiàn)了X精子和Y精子的高速分離。3.4精子分離純化后評(píng)定，應(yīng)把生分離精子準(zhǔn)確性的評(píng)價(jià)可通過兩方面來進(jìn)行:一是受精前評(píng)定,即在實(shí)驗(yàn)室分析分離精子的純度;二是受精后評(píng)定,即通過胚胎性別鑒定或者產(chǎn)出后代的性比例進(jìn)行驗(yàn)證。在實(shí)驗(yàn)室中,受精前評(píng)定分離精子樣本的準(zhǔn)確率有主要有以下三種方法:3.4.1精子的穩(wěn)定性即利用Y染色體特異核酸探針與精子上的特定序列雜交,而后標(biāo)定熒光物質(zhì),在熒光顯微鏡下直接觀察并區(qū)分X精子和Y精子。該方法特別適用于X精子和Y精子DNA含量差別很微小,重分析不能保證準(zhǔn)確性的情況。比如人的精子,用FISH法分析分離精子的純度要優(yōu)于重分析法,因?yàn)槿说腦和Y精子的DNA含量差異僅為2.8%,重分析法不能一直保持所要求的精確性。此外,FISH法還提供了使用獨(dú)立的技術(shù)來評(píng)價(jià)分離精子有效性的機(jī)會(huì),這一點(diǎn)優(yōu)于依賴昂貴儀器設(shè)備的流式細(xì)胞儀的重分析法。但是該方法的缺陷是耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng),且試劑的價(jià)格較高。3.4.2定量pcr鑒定法即通過常規(guī)的分離精子方法先將單個(gè)精子分離進(jìn)入96孔板的每一個(gè)孔穴,利用特定引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,檢測(cè)擴(kuò)增得到的100個(gè)孔中含有X染色體還是Y染色體的比率,確定分離樣本的精子純度。定量PCR鑒定法具有準(zhǔn)確性高的特點(diǎn),但缺點(diǎn)是花費(fèi)的時(shí)間較長(zhǎng),一般要花6個(gè)小時(shí)來完成分析工作。因此,用該法來分析分離精子的準(zhǔn)確率益處不大。3.4.3分離精子的檢測(cè)其原理是先用超聲波對(duì)分離精子處理2～10秒鐘,去除精子尾巴,僅留下精子頭部,增加精子的定向效率;而后用Hoechst33342進(jìn)行重新染色,再次使精子DNA充分著色;最后通過流式細(xì)胞儀重新檢測(cè)分離精子樣本的DNA,利用高斯曲線擬合確定分離精子樣本中不同DNA含量的精子的比例,即X和Y精子的比例(圖2)。試驗(yàn)表明,分離精子重分析法與FISH以及PCR法分析得到的結(jié)果沒有顯著差異。流式細(xì)胞儀重分析方法具有高效、準(zhǔn)確、可靠和快速等優(yōu)點(diǎn),在用流式細(xì)胞儀分離家畜精子的日常研究和生產(chǎn)中,一般均采用該方法。4x精子的產(chǎn)生和發(fā)展精子分離之后,主要通過人工授精、體外受精、單精子顯微注射并結(jié)合胚胎移植等動(dòng)物繁殖新技術(shù)應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)和人類生殖醫(yī)學(xué)工程。目前,雖然利用分離精子進(jìn)行體外受精和單精子注射顯微受精均已獲得成功,并且對(duì)于諸如人等分離獲得精子數(shù)量較少及活力可能降低的分離精子來說意義非常大;但在畜牧業(yè)生產(chǎn)中,人工授精技術(shù)依然是目前最具影響力的動(dòng)物繁殖技術(shù),其與分離精子技術(shù)相結(jié)合將能更有效地推動(dòng)這項(xiàng)動(dòng)物性別控制技術(shù)的廣泛應(yīng)用。目前,家畜分離精子應(yīng)用于人工授精進(jìn)行商業(yè)化推廣的最主要缺陷仍然是分離的效率相對(duì)較低。在常規(guī)的人工授精技術(shù)操作中,每支冷凍精液通常含有10×108個(gè)有效精子,而即使是利用有一定操作難度的低劑量子宮深部人工授精技術(shù),分離精子的每個(gè)劑量通常也要分裝有2～3×106個(gè)。按照目前常規(guī)情況,每小時(shí)只能分離得到11×106個(gè)左右的X精子或Y精子,這就造成了分離精子的價(jià)格和商業(yè)化成本偏高。為提高分離的效率,將來的研究必須在流體力學(xué)上作更深入細(xì)致的工作,以期在保持液流穩(wěn)定的同時(shí)提高進(jìn)樣速度;或利用更先進(jìn)的信息處理技術(shù)更準(zhǔn)確快速地收集處理精子信號(hào),正確辨別XY精子并分離;或在精液樣本處理方面,讓精子在分離的過程暫時(shí)制動(dòng),提高精子定向和分離的效率;或開發(fā)出其它種類熒光標(biāo)記方法,X精子和Y精子不必受限于以DNA微小差別為基礎(chǔ)來進(jìn)行分離。除了分離效率外,分離精子的活力也是其中一個(gè)問題。目前,分離精子人工授精的受胎率只有常規(guī)冷凍精液的70%～80%,在管理不完善的牧場(chǎng)或者高產(chǎn)奶量的牛群中還要低一些。導(dǎo)致分離精子受精能力降低的原因是多方面的,如精子染色的過程以及激光照射的復(fù)合影響,分離精子過程中的高倍稀釋作用以及分離過程中的高壓鞘液對(duì)精子膜的破壞作用等,這些都需要進(jìn)行大量的基礎(chǔ)研究予以闡明。雖然困難重重,但由于分離精子性別控制的重大意義,近年來持續(xù)有大量科研力量和資金的投入其中,分離精子性別控制的研究在各個(gè)技術(shù)環(huán)節(jié)也正在不斷得到提高,其商業(yè)化的誘人前景正逐漸向世人展開。位于美國(guó)科羅拉多州的XY公司是較早致力于分離精子研究與開發(fā)的公司,其獲得了多項(xiàng)與分離精子相關(guān)的專利。2000年7月,在英國(guó)皇家農(nóng)業(yè)博覽會(huì)上,英國(guó)的Cogent公司作為XY公司的合作伙伴,正式宣布為其下屬的牧場(chǎng)主提供奶牛分離精子服務(wù),成為世界上第一家利用流式細(xì)胞儀投入生產(chǎn)分離精子的公司;該公司擁有全英國(guó)最優(yōu)秀的10頭公牛中的3頭,利用10臺(tái)流式細(xì)胞儀24小時(shí)運(yùn)作生產(chǎn)分離精子。目前其分離精子市場(chǎng)處于供不應(yīng)求狀態(tài)?，F(xiàn)在除美國(guó)和英國(guó)外,利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分離精子研究的國(guó)家還有瑞士、日本、澳大利亞、德國(guó)和阿根廷等國(guó)。中國(guó)分離精子研究起步較晚,但發(fā)展非常迅速。廣西大學(xué)動(dòng)物繁殖研究在2002年購(gòu)入一臺(tái)流式細(xì)胞儀,率先在國(guó)內(nèi)開展了分離精子性別控制的研究,現(xiàn)已初