實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)卵清蛋白

雞蛋清中卵清蛋白的提取及其活性測定生命科學(xué)學(xué)院生化實(shí)驗(yàn)操作大賽1精品課件Contents實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)材料及用品實(shí)驗(yàn)本卷須知實(shí)驗(yàn)步驟2精品課件實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握提取雞蛋清中卵清蛋白的根本原理和方法。2.掌握紫外分光光度計(jì)的使用方法及本卷須知。3.掌握用紫外吸收法測定蛋白質(zhì)活性，了解其他測定蛋白質(zhì)活性的方法。3精品課件實(shí)驗(yàn)原理一、沉淀法粗別離蛋白質(zhì)沉淀法是別離純化生物大分子物質(zhì)常用的一種經(jīng)典方法，可分鹽析法、等電點(diǎn)沉淀法和有機(jī)溶劑沉淀法等。蛋白質(zhì)分子外表含有帶電荷基團(tuán)，這些基團(tuán)與水分子有較大的親和力，故蛋白質(zhì)在水溶液中能形成水化膜，增加了蛋白質(zhì)水溶液的穩(wěn)定性。如果在蛋白質(zhì)溶液中參加大量中性鹽，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子外表電荷被中和，水化膜被破壞，最終引起蛋白質(zhì)分子間相互聚集并從溶液中析出，這就是鹽析作用。由于各種蛋白質(zhì)分子外表的極性基團(tuán)所帶電荷數(shù)目不同，它們在蛋白質(zhì)外表上的分布情況也不一樣，因此，將不同蛋白質(zhì)鹽析出來所需要的鹽濃度也各異，鹽析法就是通過控制鹽的濃度，使蛋白質(zhì)混合液中的各個(gè)成分分步鹽析出來，到達(dá)粗別離蛋白質(zhì)的目的。4精品課件實(shí)驗(yàn)原理雞蛋清的主要成分是球蛋白和白蛋白〔卵清蛋白〕，球蛋白可在半飽和硫酸銨溶液中析出，而卵清蛋白那么在飽和硫酸銨溶液中才能析出。蛋白質(zhì)的鹽析作用是可逆過程，由鹽析獲得的蛋白質(zhì)沉淀，當(dāng)降低其鹽類濃度時(shí)，又能再溶解，因而可初步純化蛋白質(zhì)。等電點(diǎn)沉淀法是利用蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小來別離具有不同等電點(diǎn)蛋白質(zhì)的方法。蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，蛋白質(zhì)分子的電荷性質(zhì)和數(shù)量因PH不同而變化，蛋白質(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí)，其凈電荷為零，由于相鄰蛋白質(zhì)分子之間沒有靜電斥力而趨于聚集沉淀，因此，在其他條件相同時(shí)，它的溶解度到達(dá)最低點(diǎn)。卵清蛋白的等電點(diǎn)為4.6-4.8，而球蛋白的等電點(diǎn)是5.1。5精品課件蛋清中各種蛋白的理化性質(zhì)名稱比例分子量KDa等電點(diǎn)卵清蛋白52%454.5伴清蛋白13%786.6溶菌酶11%284.0-4.3卵類粘蛋白3.5%1410.7卵粘蛋白1.5%18(α)400(β)4.7免疫球蛋白<1.0%不同不同6精品課件實(shí)驗(yàn)原理二、蛋白質(zhì)的活性測定根據(jù)蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)，測定蛋白質(zhì)的方法有凱氏定氮法、紫外吸收法、Folin-酚法、考馬斯亮藍(lán)G-250染色法等。由于蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外線的性質(zhì)，吸收頂峰在280nm波長處。在此波長范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值〔A280〕與其含量呈正比關(guān)系，可用作定量測定。由于核酸在280波長處也有光吸收，對蛋白質(zhì)的測定有干擾作用，但核酸的最大吸收峰在260nm處，如同時(shí)測定260nm的光吸收，通過計(jì)算可能消除其對蛋白質(zhì)測定的影響，因此溶液中存在核酸時(shí)必須同時(shí)測定280nm及260nm的光密度，方可通過計(jì)算測得溶液中的蛋白質(zhì)濃度。7精品課件實(shí)驗(yàn)方法一.蛋白質(zhì)提取鹽析+等電點(diǎn)沉淀法可用作鹽析的中性鹽有過硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉、硫酸銨等。其中應(yīng)用最廣的是硫酸銨，硫酸銨在水中溶解度大，25℃可達(dá)4.1mol/L的濃度，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，溶解度的溫度系數(shù)變化較小，價(jià)廉易得；分段效果較其他鹽好，性質(zhì)溫和，即使?jié)舛群芨邥r(shí)也不會(huì)影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。等電點(diǎn)沉淀法是利用蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小來別離具有不同等電點(diǎn)蛋白質(zhì)的方法。其他方法〔一〕根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的別離方法：低溫有機(jī)溶劑沉淀法〔二〕根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差異的別離方法：透析與超濾、凝膠過濾法〔三〕根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進(jìn)行別離：電泳法、離子交換層析法8精品課件實(shí)驗(yàn)方法二.蛋白質(zhì)活性測定

紫外吸收法

紫外線吸收法測定蛋白質(zhì)含量的優(yōu)點(diǎn)是迅速、簡便、不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定。

其他方法

凱氏定氮法，雙縮尿法、Folin－酚試劑法、考馬斯亮藍(lán)法9精品課件實(shí)驗(yàn)材料及用品1、材料：

新鮮雞蛋2、試劑：

飽和硫酸銨、硫酸銨結(jié)晶、生理鹽水、1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白液3、器具：紫外分光光度計(jì)、離心機(jī)、恒溫水浴鍋、冰箱、電子天平10精品課件實(shí)驗(yàn)步驟一.卵清蛋白的提取11精品課件實(shí)驗(yàn)步驟二.卵清蛋白活性測定：〔一〕紫外吸收法測定卵清蛋白的含量1、標(biāo)準(zhǔn)曲線法〔1〕標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制按下表分別向每支試管參加各種試劑，搖勻。在280nm波長處分別測定各管溶液的A280值。以A280值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。試管號試劑123456789提取液標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液/mL00.51.01.52.02.53.04.01.0蒸餾水/mL4.03.53.02.52.01.51.003.0蛋白質(zhì)濃度/mg/mL00.1250.250.3750.500.6250.751.0A28012精品課件實(shí)驗(yàn)步驟〔二〕蛋白提取液中蛋白質(zhì)含量測定1、提取液分別稀釋1倍、10倍、20倍后，取待測蛋白質(zhì)溶液1ml，參加蒸餾水3ml，搖勻，按上述方法在280nm波長處測定光吸收值，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出經(jīng)稀釋的待測蛋白質(zhì)的濃度。排除干擾：將待測蛋白質(zhì)溶液適當(dāng)稀釋，在波長260nm和280nm處分別測出A值，然后利用280nm及260nm下的吸收差求出蛋白質(zhì)濃度。2.計(jì)算：蛋白質(zhì)濃度〔mg/ml〕=1.45A280-0.74A260〔式中A280和A260分別是該溶液在280nm和260nm波長下測得的光吸收值〕13精品課件實(shí)驗(yàn)本卷須知1

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蛋白質(zhì)提取過程中須注意溫度的控制，一般在20℃

以下進(jìn)行調(diào)節(jié)等電點(diǎn)一定要準(zhǔn)確，在本實(shí)驗(yàn)中，球蛋白和卵