多肽分子自組裝研究進展

多肽分子自組裝研究進展

多孔分子的自組裝現(xiàn)象在自然界廣泛存在，但采用多孔自組裝技術(shù)制備納米材料只有10多年。Ghadiri等最先利用自組裝技術(shù)合成多肽納米管。環(huán)狀的多肽首先形成似β-折疊結(jié)構(gòu),然后相互疊在一起形成多肽納米管(如圖1所示)。1993年張曙光等發(fā)現(xiàn)一種可以進行自組裝的離子互補型多肽,并用這種多肽合成了水凝膠膜。目前多肽自組裝技術(shù)已成為材料學、分子生物學、醫(yī)學等眾多學科研究的熱點。1納米材料的制備技術(shù)多肽自組裝技術(shù)就是利用多肽分子在熱力學平衡條件下通過非共價鍵間的相互作用自發(fā)形成穩(wěn)定的聚集態(tài)結(jié)構(gòu),制備具有特殊功能的材料的技術(shù)。多肽分子自組裝技術(shù)具有以下優(yōu)點:(1)可在單體水平上設(shè)計并形成高度有序的納米結(jié)構(gòu);(2)合成過程中不生成共價健,沒有逆反應(yīng)。1.1自組裝聚集體結(jié)構(gòu)的預(yù)測和控制多肽自組裝機理是指多肽分子非共價鍵間的相互作用的微觀機理。自組裝機理的研究,對準確地預(yù)測和控制多肽自組裝聚集體的結(jié)構(gòu)起著極為重要的作用。關(guān)于這方面的工作,目前已有眾多理論,其中分子間作用力理論是研究較早、較廣泛的一種理論,常用于多肽分子自組裝的設(shè)計。分子的兩親性、分子間的靜電力、分子間的氫鍵對多肽自組裝具有重要影響。1.1.1自組裝多肽分子并進行聚集體的設(shè)計兩親多肽分子中親水基團和疏水基團相互作用可以形成各種不同結(jié)構(gòu)的聚集體,如膠束、膠囊、薄片、束帶和納米管等。而且通過改變和控制這兩部分的結(jié)構(gòu),可以設(shè)計出不同功能的自組裝多肽分子并得到不同結(jié)構(gòu)的聚集體。例如,氨基端乙酰化的兩親多肽[如Ac-(Ala)-Asp,Ac-(Va1)6-Asp-Asp]在中性條件下可以自組裝形成納米管,而分子疏水性較強的多肽Ac-(Leu)6-Asp-Asp可以形成多肽納米管、棒狀膠束和囊泡。1.1.2靜電力作用的裝置多肽分子中帶正電的氨基酸殘基和帶負電的氨基酸殘基通過靜電作用影響其自組裝行為。例如,含有16個氨基酸殘基的多肽EAK16可以在鹽存在的情況下自發(fā)形成膜。在EAK16中,帶正電的氨基酸殘基(賴氨酸K)和帶負電的氨基酸殘基(谷氨酸E)被疏水性殘基(丙氨酸A)分開,并且谷氨酸E和賴氨酸K之間形成互補的離子鍵,這種離子鍵之間的靜電力作用對形成穩(wěn)定的多肽膜是非常重要的。靜電力與分子的兩親性相結(jié)合,可以使多肽分子自組裝成多肽納米纖維、多肽納米管、多肽水凝膠等。另外,帶電體A和B之間通過靜電力產(chǎn)生的能量:Z是帶電體所帶電荷數(shù),ε是一個電子的電量,r是A、B之間的距離,D是介電常數(shù)。介電常數(shù)D隨著溶液中鹽濃度的變化而改變,因此可以通過溶液中鹽濃度加以控制靜電力產(chǎn)生的能量,這對聚集體結(jié)構(gòu)的控制具有重要的應(yīng)用價值。1.1.3l--型環(huán)形多肽的結(jié)構(gòu)及協(xié)同作用從鍵長和鍵能上看,氫鍵位于化學鍵與非成鍵作用之間。它具有特殊的幾何構(gòu)型和方向性,這使氫鍵在多肽分子組裝過程中起著重要的作用。例如,游離的疏水二肽L-Val-L-Ala可以通過氫鍵頭尾相連形成一個六邊形管狀結(jié)構(gòu),該管的孔徑為0.52nm(如圖2所示)。文獻指出,根據(jù)氫鍵協(xié)同效應(yīng)的電荷傳遞機制,D,L-α-型環(huán)狀多肽不僅主鏈間的存在氫鍵作用,而且側(cè)鏈間氫鍵的相互作用及其協(xié)同效應(yīng)對D,L-α-型多肽環(huán)的自組裝行為具有重要的影響。雖然多肽分子間的這些非共價鍵力的強度都很弱,但它們相互結(jié)合仍可以形成穩(wěn)定的聚集態(tài)結(jié)構(gòu)。多肽分子的自組裝經(jīng)常是這些力共同作用的結(jié)果。目前對多肽自組裝理論的研究正不斷的深入,其中計算機模擬技術(shù)已成為研究自組裝的有力工具。這種方法可以模擬自組裝多肽單體、模擬多肽自組裝過程、多肽序列與結(jié)構(gòu)。1.2多肽“分子開關(guān)”多肽分子結(jié)構(gòu)簡單、種類繁多、易于改性、具有相對的穩(wěn)定性能,是納米器件的理想構(gòu)造單元。根據(jù)自組裝系統(tǒng)的功能和應(yīng)用,多肽分子主要有以下幾種:分子積木、多肽涂料、多肽表面活性劑、多肽分子開關(guān)。已有文獻對自組裝多肽進行了詳細的分類,本文只作簡單介紹。具有不同性質(zhì)的表面,其親水與疏水表面像積木的楔和孔一樣,能自組裝成不同的結(jié)構(gòu),具有這種結(jié)構(gòu)的多肽被稱為多肽“分子積木”。例如帶正電的氨基酸殘基(精氨酸R)和帶負電的氨基酸殘基(天冬氨酸D)被疏水性殘基(丙氨酸A)分開,形成具有代表性的自組裝多肽“分子積木”-RAD16。它們在水溶液中形成非常穩(wěn)定的β-折疊結(jié)構(gòu),在高濃度鹽溶液中則自組裝成(-折疊交聯(lián)的膜,也可形成由帶孔的納米纖維構(gòu)成的三維支架,用于材料的表面生物活性改性和組織工程支架的制備。多肽“分子涂料”可以在材料表面進行自組裝,改善材料的生物活性,為細胞的黏附、生長、增值提供物質(zhì)基礎(chǔ)。這種結(jié)構(gòu)的分子由三部分組成:與特異的細胞識別與黏附有關(guān)的配體區(qū);與材料表面共價結(jié)合的錨定區(qū);將二者分隔的連接區(qū)。代表性的有RADSC-14和RADSC-16等。如果設(shè)計不同的配體和錨定基團,多肽涂料可以用于特定種類細胞的識別和不同基質(zhì)材料的表面修飾,為細胞間信息的傳遞和細胞功能的研究提供新方法。例如,一系列含有細胞黏附功能,如含有(RADS)n,的多肽通過連接分子被固定在金的表面。細胞通過識別(RADS)n被黏附在金的表面,從而增強了金對細胞的黏附能力。多肽“表面活性劑”具有與脂類表面活性劑相類似的兩性結(jié)構(gòu)。分子一般包含7～8個氨基酸,其中1～2個帶電氨基酸組成親水性頭部,6～7個非極性氨基酸組成疏水性尾部。這種分子的尺寸具有不連續(xù)性且分布較寬。多肽表面活性劑在水中經(jīng)過自組裝形成平均直徑30～50nm的管狀或泡狀結(jié)構(gòu)(如圖4所示)。這些“納米容器”可用作藥物緩釋的載體。多肽“分子開關(guān)”能在外界條件改變時發(fā)生結(jié)構(gòu)上的突變,可用于分子元件中的開關(guān)系統(tǒng),因此得名。DAR16-IV和EAK12是具有代表性的多肽“分子開關(guān)。由16個氨基酸組成的多肽DAR16-IV,在室溫下是β-折疊結(jié)構(gòu),長約5nm;但是在高溫下是α-螺旋結(jié)構(gòu),長為2.5nm。另外,科研人員還發(fā)現(xiàn)了根據(jù)pH值、結(jié)晶狀況等而改變構(gòu)象的“多肽分子開關(guān)”。2膜生物體對人體生物和膜生物體多肽自組裝技術(shù)已經(jīng)在很多領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用價值,如生物醫(yī)學、納米科技、材料科學等,尤其在生物醫(yī)學上更是格外引人注目。這是因為多肽是人體重要的組成部份,具有良好的生物相容性和較高的生物活性。2.1材料應(yīng)用2.1.1多肽自組裝納米管各種各樣的納米材料中,尺寸在1nm～100nm范圍內(nèi)的納米管因其具有特殊形狀和性質(zhì),在眾多學科中具有廣闊的應(yīng)用價值。多肽分子通過分子內(nèi)或者分子間的非共價鍵(如靜電作用、氫鍵)可以自組裝成多肽納米管。它們因其特殊的結(jié)構(gòu)和生物相容性,可以作為藥物、基因的載體材料。兩性多肽(如V6D)可以自組裝成多肽納米管。V6D多肽分子單體長度為2nm左右,在水溶液中兩個多肽單體連接成為一個環(huán),多個“多肽環(huán)”在相互疊在一起直到形成管狀結(jié)構(gòu)(如圖4所示)。通過具有三個方向的連接點作為核心,還可以進一步形成三維的多肽納米管。TEM研究表明這種納米管的平均直徑為30～50nm,長度可以達到幾微米。這些多肽納米管還可以作為DNA載體,用于基因治療。在DNA溶液中,這些帶有正電荷的多肽自組裝納米管,把帶有負電荷的DNA包裹在里面?！叭萜鳌笨梢杂行У?至少是在某些情況下可以有效地把DNA運輸?shù)街付ǖ募毎帯４罅康膱蟮酪呀?jīng)證實這些自組裝的多肽納米管可以作為有效的基因載體應(yīng)用于基因治療中。另外,多肽自組裝納米管還可以與細胞膜共同作用,生成藥物分子出入的通道(見圖5)。不同的細胞有著不同的細胞膜結(jié)構(gòu)和特性,利用多肽自組裝技術(shù)可以設(shè)計與細胞專一結(jié)合的多肽納米管,作為藥物作用的靶點。Ghadiri等利用固相擠出技術(shù)合成了具有β-螺旋結(jié)構(gòu)的多肽并利用這種環(huán)狀的多肽制備了可以攜帶RNA到達指定的細胞納米管。Granja的研究表明環(huán)狀的多肽可以模擬生物膜之間的通道,允許兩性分子選擇性的通過。葡萄糖分子要想通過磷脂雙分子層,對孔的直徑有要求。另外管道的外部要具有憎水性促進納米管與磷脂的分開。研究表明葡萄糖分子可以通過具有10個殘基的多肽cyclo[Gln-(D-Leu-Trp)4-D-Leu]自組裝成的納米管。2.1.2自組裝型水凝膠水凝膠是大分子通過化學或者物理交聯(lián)形成的親水性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),在生理條件下溶脹并吸收大量的水,并保持完整的結(jié)構(gòu)。水凝膠可以根據(jù)外界條件的改變做出反應(yīng),如溫度、pH值、溶劑。利用這一特性可以制備各種智能型水凝膠。水凝膠在生物醫(yī)學、材料科學等眾多領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值。多肽在適當條件,可以自組裝成納米纖維,納米多肽纖維之間通過相互交聯(lián)形成多肽水凝膠。多肽水凝膠是水凝膠家族中重要的一員,在藥物緩釋方面具有潛在的應(yīng)用價值。與化學合成聚合物水凝膠相比,自組裝多肽纖維水凝膠具有很高的生物相容性,同時這種水凝膠含水率可以高達99.5%w/v。內(nèi)部的大量水性環(huán)境適合極性分子在大范圍內(nèi)擴散,適合作藥物,特別是大分子藥物載體。通過改變多肽分子的結(jié)構(gòu),還可以設(shè)計出具有特殊用途的水凝膠和各種智能型水凝膠,如pH敏感型水凝膠、離子敏感型水凝膠。Nagai等研究了多肽水凝膠模型的性質(zhì)(電荷、結(jié)構(gòu))對釋放動力學的影響。他們用具有(-折疊結(jié)構(gòu)的多肽(RADA16)自組裝形成具有含水率為99.5%w/v的水凝膠,然后以苯酚磺酞、溴酚藍等作為藥物模型。染料的擴散速度隨水凝膠含量的增加而下降,溴酚藍與水凝膠接觸緊密,不能從水凝膠中釋放。結(jié)果表明可以通過控制多肽結(jié)構(gòu)和電荷的密度來調(diào)控藥物在水凝膠中的釋放速度。(如圖6所示)2.2生物替代物維持組織工程旨在運用工程學和生命科學的原理,開發(fā)能夠修復(fù)、維持或改善組織或器官功能的生物替代物。自組裝的多肽材料具有良好的生物相容性、可調(diào)控的生物降解性,可以用作組織再生的支架料,例如軟骨的修復(fù)和促進神經(jīng)細胞生長的支架。2.2.1改善材料表面的生物透氣性組裝工程材料表面細胞相容性的改善是生物醫(yī)用材料研究的一個關(guān)鍵問題。自組裝的多肽具有良好的細胞相容性、無免疫反應(yīng)、可生物降解且產(chǎn)物對細胞無毒害作用,因此通過多肽自組裝技術(shù)把多肽直接固定在組織工程材料表面是改善細胞在材料表面吸附、生長的有效方法。Woolfson實驗室把“多肽涂料”固定在材料表面,改善材料表面的生物相容性。含有細胞黏附基團的多肽(RADS)在金屬表面自組裝成單層膜,細胞通過識別多肽RADS而黏附在基質(zhì)表面,形成特定的形貌。多肽在材料表面的自組裝改善了材料表面的生物相容性,提高了細胞的黏附能力。Wilson等在模擬人體組織的細胞外基質(zhì)涂層表面實驗中,陰離子性的海藻酸鹽和陽離子性的聚賴氨酸在海藻酸鈣表面通過靜電作用交替涂敷,形成層層自組裝的涂層。結(jié)果表明改性后的材料表面的生物相容性得到了極大的提高。張曙光等通過自組裝技術(shù)將多肽分子RADSC-14和RADSC-16固定到材料的表面,并成功地應(yīng)用于多種細胞的細胞顯型。2.2.2多肽纖維在細胞培養(yǎng)中的作用多肽分子可以自發(fā)的形成納米纖維,它們經(jīng)過物理交聯(lián)或者化學交聯(lián)可以進一步形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),用作組織工程支架材料。根據(jù)自組裝多肽結(jié)構(gòu)的特點(如圖7所示),多肽纖維支架可以分為以下三種:(1)以α-螺旋結(jié)構(gòu)的多肽纖維制備的支架α-螺旋是蛋白質(zhì)的初級或者二級結(jié)構(gòu),它是經(jīng)過多肽螺旋在一起而形成的右手螺旋結(jié)構(gòu)。具有α-螺旋結(jié)構(gòu)的短鏈多肽可以自組裝成納米纖維,而且還可以進一步交聯(lián)形成水凝膠。如Woolfson等開發(fā)了一種多肽自組裝成纖維的方法(SAF),利用這種方法合成的纖維可以繼續(xù)增長,最終形成的纖維長度約為10um、厚約50nm。經(jīng)過改進,這種技術(shù)還可以在多肽纖維上面引入分枝、節(jié)點和功能性的基團,對提高纖維支架的強度是十分有利的。通過改變非線性的多肽,還可以形成不同形態(tài)的纖維和不同的多肽三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。Potekhin等也開發(fā)出一種不同于SAF的α-螺旋多肽合成纖維方法,它不是利用特定的側(cè)鏈的相互作用,而是利用分子鏈上面分布的重復(fù)單元(identicalheptadrepeats)。利用這種重復(fù)單元可以在分子鏈上引入分枝、粘性的末端,因此這種方法可以制備較長的纖維。最近Villard等利用這種方法,把多肽RGD引入α-螺旋自組裝形成的纖維中。具有識別功能的RGD加強了細胞在支架上的黏附,細胞增值能力得到提高。(2)以β-折疊結(jié)構(gòu)多肽纖維制備的支架具有β-折疊結(jié)構(gòu)的多肽自組裝成纖維或者水凝膠的研究最為廣泛。短鏈的多肽或者更大的蛋白質(zhì)片斷首先形成β-線型結(jié)構(gòu),然后在氫鍵的作用下形成β-片層結(jié)構(gòu),兩個β-片層進一步作用生成多肽納米絲,最后形成多肽納米纖維。與α-螺旋結(jié)構(gòu)的多肽纖維相比,β-折疊結(jié)構(gòu)的多肽纖維更易生成水凝膠。β-折疊結(jié)構(gòu)廣泛存在于多肽“分子積木”自組裝制備的多肽水凝膠支架中,例如EAK16分子形成的水凝膠。EAK16分子有16個氨基酸殘基,帶電側(cè)鏈間的距離大約為0.68nm。由于形成β-折疊結(jié)構(gòu),丙氨酸殘基的甲基部分全部在折疊片的一邊,帶電的側(cè)鏈(賴氨酸和谷氨酸)則在另一邊。而且所有側(cè)鏈都垂直于折疊片的平面,交替地從平面上下兩側(cè)伸出從而形成了交替地有突出和無突出的結(jié)構(gòu),就像兒童壘高拼裝玩具的銷子和凹洞。納米多肽纖維的直徑小與10nm,它們相互交織在一起形成基質(zhì)并進一步形成具有較高含水量(>99%)的水凝膠支架。Schneider等利用這種多肽合成了一系列的pH值敏感型水凝膠,并且表現(xiàn)出較好的生物相容性。(3)以膠原結(jié)構(gòu)纖維制備的支架膠原是細胞外基質(zhì)和結(jié)蒂組織的主要成分,以膠原為主的自組裝也是研究的重點之一。膠原是由三個特殊螺旋結(jié)構(gòu)組裝在一起形成的連接緊密的10nm左右的左手超螺旋結(jié)構(gòu)。Pandya等利用“粘性末端”的概念通過SAF合成出多肽纖維。Hartgerink等利用化學結(jié)構(gòu)上的聯(lián)結(jié)點的方法合成出較大的多肽,通過電子顯微鏡可以觀察到似膠原結(jié)構(gòu)和網(wǎng)狀的結(jié)構(gòu)。具有膠原結(jié)構(gòu)的多肽自組裝形成纖維結(jié)構(gòu)和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),通過改性還可以使其具有特殊的功能。膠原纖維凝膠可以培養(yǎng)或者重建多種細胞,如神經(jīng)細胞、軟骨細胞、皮膚細胞、心肌細胞。多肽纖維支架,特別是多肽水凝膠具有較高的生物活性,可以用來模擬細胞外基質(zhì),為細胞的生長提供一個理想的生活環(huán)境。這些支架根據(jù)所培養(yǎng)細胞的特征,改變短肽的氨基酸序列、帶電性質(zhì),可以為細胞量身打造支架材料。在多肽水凝膠中,大量吸收的水分充斥于聚合物網(wǎng)絡(luò)中,被交聯(lián)的大分子鏈在較大程度上伸展,使整個材料具備了一種流體的性質(zhì),可以模擬充盈有大量水性液體的機體組織。多肽水凝膠柔軟、潤濕的表面以及與組織的親和性大大減少了支架材料對細胞產(chǎn)生的刺激,因此具有較高的生物相容性。多肽水凝膠可以培養(yǎng)多種細胞,如人體主動脈內(nèi)皮細胞、軟骨細胞、纖維細胞、角質(zhì)化細胞等。如張曙光等利用多肽(RAD16和EAK16)自組裝技術(shù)制備了一系列的多肽水凝膠支架材料,并且利用這些多肽水凝膠成功地培養(yǎng)了多種細胞和組織,例如海馬組織切片、肝干細胞、成軟骨細胞等。相比其它細胞,神經(jīng)細胞的培養(yǎng)和修復(fù)較困難,對支架材料要求較高。中樞神經(jīng)的軸突在多肽水凝膠支架中可以再生,受損組織的功能也可以得到恢復(fù),因此多肽水凝膠支架在神經(jīng)細胞的培養(yǎng)與修復(fù)方面具有優(yōu)勢。Holmes等采用多肽RAD16-ll自組裝成水凝膠,在老鼠PC12細胞實驗中,細胞粘附到水凝膠支架上,且具有立方型的外觀,這說明水凝膠包裹在細胞的周圍。在神經(jīng)因子處理后的24h,神經(jīng)突出沿著凝膠支架廣泛的生長,可見神經(jīng)細胞在支架中具有很好的活性。MIT小組利用水凝膠開發(fā)了一種用于神經(jīng)細胞培養(yǎng)的支架材料-納米多肽纖維支架溶液。溶液里的多肽如同微型的蜂巢。每一個“蜂巢”的長度為0.0000002in。當注入動物的神經(jīng)細胞時,溶液在受傷的裂縫之間流動,然后這些分子在幾個神經(jīng)元之間把裂縫連接在一起形成支架。細胞在支架上面增殖。這種支架為神經(jīng)