基于mdna控制區(qū)的鄉(xiāng)土綠殼蛋雞遺傳多態(tài)性分析

基于mdna控制區(qū)的鄉(xiāng)土綠殼蛋雞遺傳多態(tài)性分析

烏江，又名烏骨雞，是中國鳥類品種的基本特征。經(jīng)過長期的生存，所有族裔群體形成了中國豐富多樣的烏骨遺傳資源。根據(jù)明代的本草綱目，烏骨雞有白色的骨頭，黑毛的骨頭，斑點(diǎn)狀的骨頭，肉和白骨的骨頭。然而，雞和舌黑的人是烏骨。他們有很好的藥物，甜、平、無害，對(duì)壓力、疲勞和虛弱有很好的抵抗力，治療口渴，幫助孕婦，處理各種疾病。2011年版《中國動(dòng)物遺傳資源》列出了近17種烏膚烏江（不包括某些烏膚品種）。其中，東鄉(xiāng)綠殼蛋蛋位于江西省東鄉(xiāng)縣，羽毛呈黑色，很少有個(gè)體的羽毛呈白色、麻痹或黃色。直立王冠，冠狀面，樹皮，肉，骨，足部和腳趾，主要是黑色。成年公雞的體重為719g，雞體重為1350g。東鄉(xiāng)綠殼蛋的獨(dú)特特征是外殼的顏色是綠色的。20世紀(jì)80年代以來，原生區(qū)采取了提取、對(duì)外貿(mào)易等措施，使其基本相同。每年生產(chǎn)約160枚蛋，綠殼率達(dá)到99%以上，并形成一定的產(chǎn)業(yè)規(guī)模。線粒體DNA(mtDNA)是一種核外遺傳物質(zhì),長約16.5kb,與核DNA相比,mtDNA具有相對(duì)分子質(zhì)量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、進(jìn)化快、母性遺傳、無組織特異性等特點(diǎn).其中,控制區(qū)(D-loop區(qū))為非編碼區(qū),富集A/T堿基,能被RNA聚合酶等特異分子識(shí)別,從而作為轉(zhuǎn)錄的起始序列,其進(jìn)化速率較其他區(qū)域高5~10倍［３］.因此,mtDNA控制區(qū)多態(tài)分析是目前研究動(dòng)物種群親緣關(guān)系及群體遺傳多樣性的有效途徑.本研究針對(duì)東鄉(xiāng)綠殼蛋雞保種群體,采用mtDNA控制區(qū)的PCR擴(kuò)增方法,進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè),并與國內(nèi)其他9個(gè)地方烏雞品種進(jìn)行進(jìn)化分析,以期了解其遺傳資源結(jié)構(gòu),為進(jìn)一步保護(hù)和開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù).1材料和方法1.1試驗(yàn)樣本的選擇試驗(yàn)采集的東鄉(xiāng)綠殼蛋雞樣本均來自浙江光大種禽業(yè)有限公司保種群體G11世代,共39只(公19只、母20只).每只雞翅靜脈采血1.5mL,加入盛有8mL70%乙醇的離心管中,搖勻后置-20℃保存.江山烏骨雞樣本數(shù)據(jù)來自本課題組［４］,并已被收錄于NCBI數(shù)據(jù)庫中.其余8個(gè)國內(nèi)地方烏雞種樣本根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果確定,并要求是收錄于2011年版《中國畜禽遺傳資源志·家禽志》的品種.所有試驗(yàn)樣本數(shù)據(jù)來源見表1.1.2pcr擴(kuò)增體系1.2.1血基因組DNA提取按照血基因組小量制備試劑盒(Axygen公司)的操作說明提取血樣DNA.1.2.2PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序引物設(shè)計(jì)參見文獻(xiàn),上游引物序列:5′-AGGACTACGGCTTGAAAAGC-3′;下游引物序列:5′-ATGTGCCTGACCGAGGAACCAG-3′.PCR擴(kuò)增體系:DNA模板2μL,上下游引物(10μmol/L)各1μL,10×dNTP1μL,Taq酶0.5μL,最后加ddH２O至50μL.反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性3min;94℃變性30s;60.5℃退火40s;72℃延伸40s,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10min,4℃保存.PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后,送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序.1.3序列分析和計(jì)算所測(cè)DNA序列用DNASTAR5.0軟件包進(jìn)行拼接,用ClustalX1.83進(jìn)行多重比對(duì)剪輯［６］,然后用DNASP5.10軟件分析序列多態(tài)性、提取單倍型［７］.合并所有10個(gè)烏雞種的序列,用MEGA5.10軟件計(jì)算品種間進(jìn)化分歧,并構(gòu)建單倍型系統(tǒng)發(fā)生樹[鄰接(neighbour-joining,NJ)法,Kimura雙參數(shù)模型,Bootstrap抽樣重復(fù)值=1000]［８］.2結(jié)果與分析2.1變異位點(diǎn)堿基轉(zhuǎn)換東鄉(xiāng)綠殼蛋雞mtDNA控制區(qū)的堿基組成及多態(tài)性見表2.本研究獲得的39只東鄉(xiāng)綠殼蛋雞mtDNAD-loop序列大小為534bp,包括了高變Ⅰ區(qū)和部分保守Ⅱ區(qū),其中變異位點(diǎn)有21個(gè)(單一多態(tài)位點(diǎn)7個(gè)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)14個(gè)).變異位點(diǎn)堿基發(fā)生轉(zhuǎn)換的有15個(gè),占71.4%;發(fā)生顛換的有6個(gè),占28.6%.序列的G+C含量為43.1%;核苷酸多樣度(Pｉ)平均為0.00829;核苷酸平均差異數(shù)(K)為4.42645.獲得單倍型9種,單倍型多樣度(Hｄ)平均為0.773.從公母性別來看,公雞的變異位點(diǎn)數(shù)、單倍型數(shù)、單倍型多樣度、核苷酸多樣度和核苷酸平均差異數(shù)等遺傳多態(tài)性數(shù)值均大于母雞.2.2單倍型間的遺傳距離和組成東鄉(xiāng)綠殼蛋雞mtDNA控制區(qū)的單倍型、突變位點(diǎn)及分支歸類見表3.21個(gè)突變位點(diǎn)位于高變Ⅰ區(qū)有10個(gè),占73.3%.9種單倍型中頻率最大為DXiang_3(0.410),最小頻率為0.026;計(jì)算得到單倍型間遺傳距離為0.013±0.003.根據(jù)Liu等［９］對(duì)家雞分支的劃分方法,東鄉(xiāng)綠殼蛋雞單倍型有A、B、C共3個(gè)分支類型,其中歸于A分支的樣本數(shù)最多(25個(gè)),占總樣本數(shù)的64.1%;依次為B分支(10個(gè),25.6%)、C分支(4個(gè),10.3%).2.31烏骨雞與云南省的私家車雞遺傳距離10個(gè)烏雞種的進(jìn)化分歧估計(jì)值見表4.由表4可見,東鄉(xiāng)綠殼蛋雞與同處江西省的泰和絲羽烏骨雞的分歧值最小,為0.009,表明兩者遺傳距離最近.湖北省的鄖縣烏骨雞與云南省的騰沖雪雞分歧值最大(0.020);與云南省的鹽津?yàn)豕请u分歧值其次(0.019).江西省的東鄉(xiāng)、泰和、余干3種烏雞之間分歧值小(0.009~0.012).云南騰沖和鹽津2種烏雞之間分歧值大(0.018),同時(shí)它們分別與其他各省烏雞種的分歧值也都大(0.015~0.020).2.41不同品種雞的國內(nèi)分支及g/l分析分析10個(gè)烏雞種的248條序列共獲得73種單倍型(Hap_1-Hap_73),基于單倍型的系統(tǒng)發(fā)生樹見圖1.由圖1可見,10個(gè)烏雞種群體可歸為6大分支起源.紅色原雞spadiceus亞種(NCBI參考序列:NC_007235)與單倍型Hap_2歸在一起;并與Hap_5、Hap_8、Hap_9等24種單倍型共同構(gòu)成B分支.Hap_1與Hap_3、Hap_6、Hap_7等13種單倍型共同構(gòu)成A分支.Hap_4與Hap_13、Hap_14、Hap_15等8種單倍型共同構(gòu)成C分支(Hap_13單倍型比較偏離C分支,且檢測(cè)樣本數(shù)僅1只,在李慶海等［４］文章中的定名是Hap_5,并歸為D分支,本研究中將其調(diào)整劃歸為C分支).Hap_11與Hap_16、Hap_20、Hap_25等14種單倍型共同構(gòu)成E分支.Hap_42與Hap_44、Hap_45、Hap_46等8種單倍型共同構(gòu)成F分支.Hap_50與Hap_52、Hap_60、Hap_61等6種單倍型共同構(gòu)成G分支.10個(gè)烏雞種樣本數(shù)的分支歸類見表5.由表5可見,B分支包含的檢測(cè)個(gè)體最多,占31.0%(77/248);A分支其次,占27.8%(69/248).不同品種的分支組成各有偏重,東鄉(xiāng)綠殼蛋雞A分支占優(yōu)勢(shì);江山烏骨雞和烏蒙烏骨雞B分支占優(yōu)勢(shì);泰和絲羽烏骨雞A、B分支占優(yōu)勢(shì);余干烏骨雞E分支占優(yōu)勢(shì);鄖縣烏骨雞C分支占優(yōu)勢(shì);同處云南省的騰沖雪雞和鹽津?yàn)豕请u均含G分支;而10個(gè)烏雞種中只有騰沖雪雞含F(xiàn)分支,且占優(yōu)勢(shì).3討論和結(jié)論3.1mtcda變異程度檢測(cè)本研究測(cè)定的東鄉(xiāng)綠殼蛋雞mtDNAD-loop控制區(qū)G+C含量為43.1%,低于A+T含量;同時(shí)21個(gè)突變位點(diǎn)中發(fā)生顛換的有6個(gè)(6/21),表明該區(qū)域內(nèi)堿基組成具偏倚性,且顛換發(fā)生率小于轉(zhuǎn)換發(fā)生率,這與黃族豪等［１０］(0/17)、黃道平等［１１］(2/26)、貢潘偏抽等［１２］(3/27)、李輝等［１３］(1/31)、廖承紅等［１４］(0/27)和李慶海等［４］(7/30)的研究結(jié)果相似.但東鄉(xiāng)綠殼蛋雞在檢測(cè)區(qū)域的后段(450~534bp)出現(xiàn)了6個(gè)突變位點(diǎn),并且其中5個(gè)是顛換,這不同于以往的報(bào)道,反映出該雞種的獨(dú)特性.單倍型間遺傳距離、單倍型多樣度、核苷酸多樣度等是衡量群體mtDNA變異程度的重要指標(biāo),距離大、多樣度大,則群體多態(tài)性高;反之則多態(tài)性低.本研究測(cè)定的東鄉(xiāng)綠殼蛋雞單倍型間平均遺傳距離為0.013;單倍型多樣度Hd=0.773;核苷酸多樣度Pi=0.00829.通常,遺傳距離在0.01以上即被認(rèn)為mtDNA變異較大,此外,黃族豪等發(fā)現(xiàn)泰和烏雞Hd=0.768、Pi=0.0125;黃道平等發(fā)現(xiàn)西疇烏骨雞Hd=0.884、Pi=0.01452;貢潘偏抽等發(fā)現(xiàn)云南瓢雞Hd=0.883、Pi=0.01503;李輝等發(fā)現(xiàn)黔東南小香雞Hd=0.900、Pi=0.01292;廖承紅等發(fā)現(xiàn)文昌雞Hd=0.935、Pi=0.01479.與以往報(bào)道相比,東鄉(xiāng)綠殼蛋雞的單倍型多樣度、核苷酸多樣度等數(shù)值并不高,處于中等多態(tài),這是品種固有抑或與樣本采自高保種代次有關(guān),還需要進(jìn)一步驗(yàn)證.3.2品種的地域關(guān)聯(lián)性和親緣關(guān)系包文斌等［１５］研究認(rèn)為,分布于中國云南西部和西南部、印度支那半島、緬甸和馬來西亞北部的spadiceus亞種(中國紅色原雞)和分布于印度支那半島、泰國、蘇門答臘的gallus亞種(泰國紅色原雞)對(duì)中國家雞的起源均有貢獻(xiàn).本研究參考spadiceus亞種序列(NC_007235),結(jié)果發(fā)現(xiàn)其同歸于10個(gè)烏雞種的B分支,并且,B分支所包含樣本數(shù)是最多的(77/248),這充分表明國內(nèi)烏雞與中國紅色原雞的同源性強(qiáng).從遺傳進(jìn)化分析結(jié)果來看,烏雞品種之間存在地域關(guān)聯(lián)性,例如,同處江西省的東鄉(xiāng)綠殼蛋雞、泰和絲羽烏骨雞、余干烏骨雞地理位置近,分歧值也小;再如,F、G這2個(gè)分支僅在同處云南省的騰沖雪雞和鹽津?yàn)豕请u中存在.另一方面,不同地區(qū)的烏雞品種分支組成各有偏重、遺傳距離遠(yuǎn)近不同,表明烏雞品種在形成歷史上有著各自不同的母系來源和親緣關(guān)系.在