鹽酸水解法提取烏骨雞毛中的花青素及含量測定

鹽酸水解法提取烏骨雞毛中的花青素及含量測定

烏骨雞也被稱為烏骨雞，屬于鳥類、雞形、雞科和雞科。烏骨雞的藥用價值和食用價值存在于體內(nèi)黑色素物質(zhì),其具有抗誘變、提高機體免疫力、延緩衰老、抑制病毒、消除自由基、抗氧化等功能,烏骨雞黑色素已被證實是真黑色素。黑色素是一種不溶于水和幾乎所有溶劑的生物多聚體,黑色素的提取方法有蛋白酶解法、鹽酸水解法等。蛋白酶解法提取時對黑色素在形態(tài)學(xué)和化學(xué)結(jié)構(gòu)上損傷的程度小于鹽酸法,且清除自由基的效果略優(yōu)于鹽酸法,但其成本較高且在光穩(wěn)定性方面要低;鹽酸水解法對黑色素的形態(tài)和化學(xué)結(jié)構(gòu)有一定損傷,但其光穩(wěn)定性較好,操作簡單易行。以烏骨雞肉、內(nèi)臟作為原材料提取黑色素的方法已有文獻(xiàn)報道,但其原材料成本較高,難以應(yīng)用,僅停留在實驗室階段。本實驗以廢棄的黑羽烏骨雞毛為原料,利用鹽酸水解法從烏骨雞毛中提取黑色素,在單因素實驗基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面實驗分析法對烏骨雞毛中黑色素提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。1儀器、試劑和試劑Waterse2695-2489高效液相色譜儀,配有2489紫外檢測器和Empower色譜工作站,自動進(jìn)樣,美國Waters公司;AB204-S電子天平,瑞士MettlerToledo公司;KQ5200DE型超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;D-37520Osterde離心機,德國Kendro制造;MH-1000電熱套,北京科偉永興儀器有限公司;302型電熱鼓風(fēng)干燥箱,山東濰坊醫(yī)藥集團股份有限公司醫(yī)療器械廠;SHB-III循環(huán)式多用真空泵,鄭州長城科工貿(mào)有限公司。濃HCl,北京化工廠,分析純;NaOH,西隴化工股份有限公司,分析純;石油醚,天津市富宇精細(xì)化工有限公司,分析純;甲酸、30%H2O2、K2CO3、Na2SO3,天津市天力化學(xué)試劑有限公司,分析純;甲醇天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,色譜純;5-羥基吲哚-2-羧酸,Sigma公司。黑羽烏骨雞雞毛,取自漢中市黑鳳園烏雞養(yǎng)殖基地,平均日齡150d。烏骨雞毛經(jīng)洗滌晾曬,于65℃烘干備用。2實驗方法2.1烏骨雞毛黑色素的檢測方法2.1.1流動相1%甲醛參考Ito的方法,并經(jīng)試驗色譜條件確定為:色譜柱ODS-3C18柱(150mm×4.6mm,4μm),檢測波長:270nm,流速1.0ml/min,柱溫25℃,進(jìn)樣量10μL,流動相V(1%甲酸)∶V(甲醇)=60∶40,保留時間:30min。2.1.2ph值及縮合物的制備2,3,5-三羧基吡咯(PTCA)的制備參考Ito的方法:精密稱取5-羥基吲哚-2-羧酸50mg,溶于50mL1.0mol/LK2CO3溶液中,加入體積分?jǐn)?shù)30%H2O22mL,置100℃加熱20min。流水冷卻,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%Na2SO33.0mL終止反應(yīng),用6.0mol/LHCl調(diào)節(jié)pH值至1左右,冷卻,用50mL乙醚萃取5次,合并乙醚萃取液,萃取液濃縮到一定體積,揮干乙醚真空干燥。精密稱取10mg沉淀,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸定容至25mL,搖勻,作為對照品儲備液(PTCA濃度為400μg/mL)。精密吸取對照品儲備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL,分別置于5個10mL的容量瓶中,用0.1%甲酸溶液定容,混勻,即配成濃度為20、40、60、80、100μg/mL的5個不同濃度的對照品溶液。2.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將5個不同濃度的PTCA對照品溶液依次分別進(jìn)樣10μL,記錄峰面積,以峰面積(Y)為縱坐標(biāo),以濃度(X)為橫坐標(biāo),用直線回歸方程的方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,PTCA的直線方程為:Y=9.96×103X-4.99×104(r=0.999203),其濃度在20.00～100.00μg/mL內(nèi),線性關(guān)系良好。2.1.4ptca含量測定分別精密稱取(單因素實驗)提取時間3、6h所得黑色素粗品和響應(yīng)面模型驗證性實驗所得黑色素粗品各10mg,加入1.0mol/LK2CO38.6mL和體積分?jǐn)?shù)3%H2O20.8mL,置100℃水浴20min,流水冷卻后,加入10%Na2SO30.4mL終止反應(yīng),用6.0mol/LHCl調(diào)節(jié)pH值至1左右,過濾后取上清液,用50mL乙醚萃取5次,合并乙醚萃取液,萃取液濃縮到一定體積,揮干乙醚抽真空干燥后,用流動相復(fù)溶,定容至25mL,用0.45μm有機膜過濾,與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的色譜條件下進(jìn)樣,重復(fù)進(jìn)樣3次,取平均值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出PTCA的含量,通過黑色素對照樣品與PTCA含量間的換算系數(shù),得出供試品中黑色素的含量。2.1.5烏骨雞毛權(quán)的氧化稱取鹽酸水解黑色素300mg置于水解裝置中,加入10mol/LHCl120mL,密封置于120℃烘箱內(nèi)完全水解12h。揮干鹽酸后,蒸餾水洗凈,沉淀黑色素低溫干燥,作為烏骨雞毛黑色素樣品。分別精密稱取烏骨雞毛黑色素對照樣品10mg,參考2.1.2對照品溶液的制備方法進(jìn)行氧化處理,得到對照樣品溶液,按3.1.1同樣色譜條件進(jìn)樣,測得對照樣品PTCA含量,建立樣品黑色素與PTCA含量間的換算關(guān)系。烏骨雞毛黑色素樣品的對照品氧化后PTCA含量見表1。烏骨雞毛黑色素氧化后PTCA平均得率為16.18%,RSD為0.344%。因此烏骨雞毛黑色素與PTCA間的關(guān)系即:黑色素=6.21×PTCA(mg)。2.2單因素實驗與響應(yīng)面實驗采用HCl水解法提取,選擇HCl濃度、料液比和提取時間進(jìn)行單因素實驗,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面實驗,并以黑色素得率(黑色素得率/%=黑色素質(zhì)量/原材料質(zhì)量×100)為指標(biāo),確定最佳的提取條件,并對最佳提取條件進(jìn)行驗證性實驗。2.2.1單因素實驗2.2.1.熱回流提取稱取30g烏骨雞毛,置1000mL圓底燒瓶,分別加入10%、15%、20%、25%、30%HCl溶液150mL,用帶有吸收氯化氫的熱回流裝置,在110～112℃條件下,熱回流提取5h,冷卻至室溫后通過滌綸紗布粗濾。將濾液在3800r/min條件下離心10min,棄上清液。沉淀經(jīng)過多次水洗直到pH為中性,在65℃條件下烘干,即得黑色素粗品。將粗品以1∶10(g∶mL)加入石油醚,超聲2次,每次0.5h,抽濾,真空干燥得到黑色素樣品,稱重以考察鹽酸濃度對黑色素得率的影響。2.2.1.料液比對養(yǎng)殖出汁率的影響稱取30g烏骨雞毛,置1000mL圓底燒瓶,分別按1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5加入25%HCl提取,其他條件固定不變,以考察料液比對黑色素得率的影響。2.2.1.提取時間對氧化酶得率的影響試驗稱取30g烏骨雞毛,置1000mL圓底燒瓶,其它條件固定不變,分別提取2、3、4、5、6h,以考察提取時間對黑色素得率的影響。2.2.2烏骨雞毛營養(yǎng)液中激素含量對烏骨雞毛營養(yǎng)成分提取效果的響應(yīng)面分析在單因素實驗的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理,選取料液比X1(1∶1～1∶3)、HCl濃度X2(20%～30%)、提取時間X3(5～7h)3個對烏骨雞毛黑色素得率影響顯著的因素,以黑色素得率為響應(yīng)值,采用3因素3水平的響應(yīng)面分析法,設(shè)計方案見表2。3結(jié)果與分析3.1單因素試驗結(jié)果與分析3.1.1hcl濃度對aHCl濃度對黑色素得率的影響結(jié)果見圖1所示。由圖1可知,隨著HCl濃度的升高,黑色素得率呈明顯遞增趨勢,當(dāng)HCl濃度達(dá)到30%后,黑色素得率最高,在反應(yīng)過程中,由于HCl在沸騰狀態(tài)極強的揮發(fā)性,再提高HCl濃度黑色素得率也不明顯遞增,故HCl濃度以25%為宜。3.1.2不同時間點激素含量的檢測提取時間對黑色素得率的影響結(jié)果見圖2所示。由圖2可知,3h內(nèi)隨著提取時間的延長,黑色素的得率呈明顯遞增趨勢,當(dāng)提取時間達(dá)到3h后,黑色素得率隨提取時間延長而降低,到5h后,隨著提取時間延長黑色素得率稍有回升,6h后隨著提取時間延長黑色素得率趨于穩(wěn)定。上述曲線表明,3h之前可能是水解過程中未完全除去與黑色素結(jié)合的蛋白質(zhì)及脂類物質(zhì),因此黑色素得率增高;3h后,隨著與黑色素結(jié)合的蛋白質(zhì)水解,黑色素得率逐步降低,6～7h黑色素得率逐步穩(wěn)定。為了證實上述推測對3、6h提取的黑色素進(jìn)行了含量測定,結(jié)果見表3。由表3可知,水解3h黑色素樣品PTCA得率為4.31%,黑色素含量僅為26.77%;而水解6h黑色素樣品PTCA得率為12.18%,黑色素含量為75.63%,無論是PTCA得率,還是黑色素的含量都明顯高于水解3h的含量,因此水解時間選為6h。3.1.3料液比對激素得率的影響料液比對黑色素得率的影響結(jié)果見圖3所示。由圖3可知,隨著料液比的增大,黑色素得率呈明顯遞增趨勢,當(dāng)料液比達(dá)到1∶2后,黑色素得率趨于平緩,故料液比以1∶2為宜。3.2回歸模型的建立和顯著性分析響應(yīng)面分析方案及實驗結(jié)果見表4。表4中1～12是析因試驗,13～17是中心試驗。17個試驗為析因點和零點,其中分析因點為自變量取值在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維頂點;零點為區(qū)域的中心點,零點實驗重復(fù)5次,用以估計誤差。采用Designexpert8.0.6軟件對所得實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,分析結(jié)果見表5。對各因素回歸擬合后,得到黑色素得率的回歸方程:得率/%=4.7+0.2X1+0.15X2+0.086X3-0.078X1X2-0.0075X1X3-0.05X2X3-0.24X12-0.16X22-0.29X32由表5中回歸模型的方差分析可知,上述回歸方程中因變量與各自變量之間線性關(guān)系顯著(r=模型平方和/總離差平方和=0.9952),該模型高度顯著(P<0.0001),說明此實驗方法可靠。同時由于回歸方程的失擬誤差不顯著(P=0.6421),因此該回歸方程可用于實驗結(jié)果的分析和預(yù)測。各因素的方差分析表明,X1、X2、X3、X1X2、X2X3、X12、X22、X32對黑色素得率的影響顯著,由此可知各因素對黑色素得率的影響不是線性關(guān)系。由分析結(jié)果可知,HCl濃度、提取時間和料液比對黑色素得率的影響都達(dá)到了高度顯著的水平,其中料液比對黑色素得率的影響最顯著。RSM圖形是響應(yīng)值Y對應(yīng)各因素X1、X2、X3構(gòu)成的三維空間圖及三維空間圖在二維平面上的等高線圖,本實驗的RSM圖見4～圖6。各個因素交互作用對響應(yīng)值的影響可以直觀的反映出來,其中等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強弱,橢圓形表示兩因素交互作用顯著,圓形則與之相反。通過對RSM圖進(jìn)行比較可知,3個因素對響應(yīng)值影響的顯著性表現(xiàn)為曲線的陡度排列為X1(料液比)﹥X2(鹽酸濃度)﹥X3(提取時間),即3個因素對黑色素得率影響顯著性大小為料液比﹥HCl濃度﹥提取時間,該結(jié)論與回歸方程方差分析的分析結(jié)果相吻合?；貧w模型預(yù)測的烏骨雞毛黑色素提取的最佳工藝為:料液比1∶2.21,鹽酸濃度27.37%,提取時間6.11h,在此條件下黑色素得率為4.75%。3.3模型驗證實驗稱取烏骨雞毛約100g,結(jié)合實際操作情況,將最佳工藝條件修正為:料液比1∶2,鹽酸濃度27%,回流提取6h,重復(fù)3次實驗取均值對回歸模型進(jìn)行驗證,模型驗證實驗結(jié)果見表6。由表6可知,實測黑色素平均得率為4.72%,該結(jié)果與模型預(yù)測值基本相符。3.4通過驗證試驗測定了粗素中黑色素的含量驗證性實驗所得黑色素粗品中黑色素含量的測定結(jié)果見表7。4不同方法對于烏骨雞毛中激素含量的影響,其結(jié)果確定了以下幾種本實驗以黑羽烏骨雞毛為試材,利用鹽酸水解法提取黑色素,在單因素實驗基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面分析方法得到了與烏骨雞毛中黑色素提取工藝實際擬合程度較高的模型以及優(yōu)化的烏骨雞毛中黑色素的提取工藝條件:料液比1∶2(g∶mL),酸濃度27%,提取時間6h,在此條件下烏骨雞毛中黑色素得率為4.72%。提取的黑色素樣品經(jīng)氧化處理,HPLC檢測,樣品中PTCA得率為12.27%,黑色素含量為7