豬、雞及乳制品中乳酸菌的分離及耐膽鹽性能研究

豬、雞及乳制品中乳酸菌的分離及耐膽鹽性能研究

蘑菇是動物身體的正常生理菌之一。如果在腸道內(nèi)繁殖達(dá)到一定數(shù)量，它將改善和調(diào)節(jié)主體內(nèi)微生物菌群的平衡，對主衛(wèi)生起到有益的作用。ch。促進動物對營養(yǎng)物質(zhì)吸收、增強動物機體免疫力、抑制有害細(xì)菌生長等作用［２］。乳酸菌不但賦予發(fā)酵食品特有的風(fēng)味,還具有一定的益生功能。Metchnikoff在1908年首次提出攝食發(fā)酵食品對人體具有保健功能,而發(fā)酵食品的保健功能得益于其中的微生物,現(xiàn)已明確發(fā)酵食品中的乳酸菌對人體具有多種保健功能,如提高機體免疫力［３］。乳酸菌等益生菌能否發(fā)揮作用,取決于菌株能否通過胃腸道的酸性環(huán)境以活菌的狀態(tài)到達(dá)小腸,從而發(fā)揮微生態(tài)的益生功能［４］。因此,篩選能夠進入腸道、具有高生存性的乳酸菌,是益生菌開發(fā)首要考慮的問題。內(nèi)蒙古作為我國的傳統(tǒng)牧區(qū),乳制品是當(dāng)?shù)啬撩竦闹饕澄飦碓?。傳統(tǒng)的乳制品加工方法經(jīng)過數(shù)百年的優(yōu)化,篩選,較好地保存了當(dāng)?shù)刈匀画h(huán)境中的有益乳酸菌,是天然的乳酸菌貯存庫［５］。本試驗從內(nèi)蒙古阿拉善牧戶家中采集的酸奶及酸駝乳樣品以及呼和浩特某養(yǎng)豬廠和養(yǎng)雞場成功地分離了30株乳酸菌,獲得了6株具有耐酸和耐膽鹽的高生存性乳酸菌(菌株分離采用厭氧培養(yǎng)法),并對這6株菌的耐酸以及耐膽鹽特性進行了詳細(xì)的分析。1材料和方法1.1培養(yǎng)基mrs1.1.1樣品來源傳統(tǒng)乳制品(酸奶和酸駝乳):阿拉善牧區(qū)(隨機采集,采集后4℃保藏備用)。豬:呼和浩特市賽罕區(qū)快活林養(yǎng)豬場(隨機抓取豬,然后取其腸內(nèi)容物分離目的菌株)。雞:前不塔氣村養(yǎng)雞場(隨機抓取雞,然后取其腸內(nèi)容物分離目的菌株)。1.1.2培養(yǎng)基MRS液體和固體培養(yǎng)基。1.1.3主要試劑牛膽鹽3號(BD),Becton,Dick-insonandCompany;豬膽鹽,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司050110。1.2菌株的活化與培養(yǎng)1.2.1菌株的分離純化將采集到的樣品做10×稀釋,選取合適的稀釋度涂布MRS平板,37℃厭氧培養(yǎng)48h,挑取單個可疑菌落進行涂片、革蘭染色、鏡檢,選擇G＋菌且無芽胞的菌株,繼續(xù)在MRS［６］平板上反復(fù)劃線純化,液體培養(yǎng),將菌液與滅菌甘油按1∶1混合置于-20℃冰箱進行菌種保藏。1.2.2菌株的耐酸性試驗1.2.2.1將甘油保護劑中保存的菌株在MRS液體培養(yǎng)基中連續(xù)活化3代。1.2.2.2活化好的菌液在4000r/min離心25min,棄去上清液,沉淀菌體用滅菌MRS液體培養(yǎng)基洗滌3次,將菌體重懸于此培養(yǎng)基中并調(diào)整菌懸液濃度為3.0×10８cfu/mL。1.2.2.3用濃度為1mol/L的HCl和1mol/L的NaOH將菌液的pH調(diào)整為2和3兩個試驗梯度,放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中,2h后取出,立即做梯度稀釋,選取合適的稀釋度吸取1mL稀釋液涂布MRS平板,37℃培養(yǎng)48h后計數(shù)菌落,記錄結(jié)果并計算其存活率,做3個平行試驗求平均值［７］。同時用放置0h的菌液作為對照。1.2.3菌株的耐膽鹽試驗取上述1.2.2中制備的菌懸液分組,分別加入1.0、2.0、3.0g/L的豬膽鹽和牛膽鹽,放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中3h取出,立即做梯度稀釋,選取合適的稀釋度吸取1mL稀釋液涂布MRS平板,37℃培養(yǎng)48h后菌落計數(shù)。存活率計算公式同上。2結(jié)果2.1分離菌種比例2.1.1菌株分離鑒定結(jié)果試驗結(jié)果初步表明,分離到的30株均為乳酸菌(表1)。由表1可知,乳桿菌共18株,占所分離菌株的60%;乳球菌共12株,占所分離菌株的40%。2.1.2經(jīng)過初篩得到的6株乳酸菌分別命名為LS、LZ1、LT、LJ1、LZ2、LJ2,其菌落特征及菌體形態(tài)見表2。2.2u3000ls和lj2的存活率經(jīng)耐酸試驗,分離到的6株乳酸菌對pH2.0和pH3.0的不同生長環(huán)境表現(xiàn)出不同程度的耐受性。有2株菌在pH2.0環(huán)境下存活率高達(dá)135%和124%,分別是LS和LJ2,它們在pH3.0條件下也具有較高存活率;LZ1和LT在pH2.0條件下存活率較低,僅為23%和19%,而LZ1在pH3.0時存活率可達(dá)137%;其余菌株的存活率從43%~82%不等,結(jié)果見表3。2.3菌株的生存率及致病結(jié)果2.3.1不同濃度豬膽鹽中菌株耐受結(jié)果不同濃度豬膽鹽中菌株耐受結(jié)果如表4。在豬膽鹽濃度為1.0g/L時各株菌的生存率變化很大,從最低的49%到最高的132%之間;當(dāng)膽鹽濃度為2.0g/L時,各株菌的生存率較1.0g/L時有所降低,平均為59%;當(dāng)膽鹽濃度達(dá)到3.0g/L時,存活率明顯降低,平均為45%。其中LJ1在各濃度膽鹽中的存活率都達(dá)到了60%以上,在3.0g/L時高達(dá)69%,最為穩(wěn)定。2.3.2不同濃度牛膽鹽中菌株耐受結(jié)果不同濃度牛膽鹽中菌株耐受結(jié)果見表5。本試驗中的6株菌在不同濃度的牛膽鹽中也有不同程度的存活率,其中LT菌株在各濃度條件下都表現(xiàn)出較高的存活率,分別為100%、89%、99%,其他各菌株的耐受能力隨著膽鹽濃度的提高而降低。3菌株在膽鹽中的生長特性乳酸菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群、增強機體免疫力等益生作用［８－１０］。而乳酸菌能夠充分發(fā)揮益生作用的前提是可以大量、有活性地通過家畜胃腸道,家畜胃腸道微生物眾多,胃酸、膽汁構(gòu)成了一道天然屏障,只有那些高活性的乳酸菌能夠耐受這樣的內(nèi)環(huán)境,所以本實驗的主要目的是鑒定分離到的乳酸菌是否具有高的生存性。動物肝臟分泌到十二指腸中的高濃度的膽酸鹽具有抗菌活性,它對細(xì)胞膜有很強的破壞能力,其疏水作用能使乳酸菌細(xì)胞膜膜脂溶解,導(dǎo)致膜蛋白離解和細(xì)胞膜破裂。本試驗分離株LJ1在豬膽鹽中表現(xiàn)較高存活率,高達(dá)132%,而在牛膽鹽中分離株LT存活率達(dá)到100%。由此可以看出,不同菌株在不同的膽鹽培養(yǎng)基中的存活率有較大差異。對哺乳仔豬而言,其膽囊內(nèi)膽汁量很少,在出生后3周內(nèi)膽汁量增加緩慢［１１］,一般在0.3g/L~3.0g/L范圍內(nèi)波動,本試驗所用試驗豬均非哺乳仔豬,膽汁生成量充足,可以促進大量乳酸菌細(xì)胞膜的破裂,從而表現(xiàn)較高的生存活性,因此對豬膽鹽表現(xiàn)出較高的耐受能力。同時,膽鹽能在動物小腸形成高滲透壓環(huán)境,而多數(shù)動物腸道膽鹽濃度范圍為0.3g/L~3.0g/L。［１２］所以本試驗選擇膽鹽濃度范圍在1.0g/L~3.0g/L。ChouLS等［１３］研究發(fā)現(xiàn)用膽鹽選擇性馴化乳桿菌的膽鹽耐受性是有效的,經(jīng)過幾代膽鹽馴化后得到的乳桿菌耐膽鹽的能力比親代乳桿菌強,而本實驗結(jié)果得到的乳酸菌LJ1和LT未經(jīng)過不同酸度、不同膽鹽濃度的培養(yǎng)基馴化,就有較強的耐酸和膽鹽耐受性,這一結(jié)果與這些菌株的特殊生存環(huán)境有密切關(guān)系,即當(dāng)?shù)厮岫缺容^高的發(fā)酵奶,而且此類發(fā)酵乳制品的發(fā)酵劑也是已發(fā)酵的駝奶,他們不做酸駝奶時,低溫保存已發(fā)酵的酸駝奶,這種制作工藝恰恰給其里面的乳酸菌賜予自然馴化的生存環(huán)境,因此這些乳酸菌具有一定的耐受性。這些菌株在進一步確定其它益生能力后