神經(jīng)肌肉病病理診斷的發(fā)展歷程

神經(jīng)肌肉病病理診斷的發(fā)展歷程

病理診斷是確定疾病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,盡管現(xiàn)代影像學(xué)檢查等多種無創(chuàng)檢查技術(shù)可以為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷提供可靠的病變部位,但常常仍難以明確病變性質(zhì)。為明確診斷,應(yīng)鼓勵(lì)有針對(duì)性的開展活體組織的病理檢查。1肌肉病的診斷自1865年Criesinger首先實(shí)施開放性肌肉活檢,1868年Duchenn制作肌肉活檢針研究肌肉疾病,到1953年DennykBrown和Pearson撰寫的第一部肌肉疾病專著問世,80多年間神經(jīng)肌肉病的臨床病理診斷發(fā)展很慢,直到20世紀(jì)60年代,恒冷冰凍切片技術(shù)、酶組織化學(xué)技術(shù)和電鏡的應(yīng)用,才使神經(jīng)肌肉病的病理診斷有了長(zhǎng)足的發(fā)展。20世紀(jì)80年代,我國(guó)北京、上海、南京、濟(jì)南、長(zhǎng)沙、福州、長(zhǎng)春等地相繼開展了神經(jīng)肌肉病的臨床病理診斷工作;1991年中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)肌肉學(xué)組成立;2000年以來采用免疫組織化學(xué)技術(shù),應(yīng)用不同的抗體對(duì)病變肌肉組織作出準(zhǔn)確的定位,進(jìn)一步提高了肌肉活檢的診斷水平。肌肉活檢多由神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)生親自操作,因?yàn)槭煜げ∽兝奂暗牟课?能選取適合診斷的肌肉。目前國(guó)外推崇針刺活檢,認(rèn)為取材創(chuàng)傷小,可以多次、多部位取材,但針刺活檢取材量小,難以反映疾病的全貌,而且,為選取滿意的檢查樣品多次取材,損傷也不小,而且不是直視下取材,有傷及周圍神經(jīng)和血管的風(fēng)險(xiǎn),所以目前國(guó)內(nèi)各家仍采用開放性肌肉活檢。早年肌肉活檢病理診斷發(fā)展緩慢,是由于僅用石蠟切片,在制片過程中許多組織成分丟失,偽差較多。冰凍切片酶組化染色使大部分組織結(jié)構(gòu)保留,提高了活檢的診斷水平,發(fā)現(xiàn)了許多新病種,在此基礎(chǔ)上,分子基因及其編碼蛋白的檢測(cè)使許多遺傳性神經(jīng)肌肉病的基因得以確立,神經(jīng)生化檢查為代謝性肌肉疾病進(jìn)一步分出了亞類,結(jié)合神經(jīng)電生理、超聲及影像學(xué)的檢查,使人們對(duì)神經(jīng)肌肉疾病從簡(jiǎn)單的臨床病理研究發(fā)展到了基因和蛋白分子水平的診斷。2肌肉激活法2.1超聲檢查的應(yīng)用肌肉活檢選位的原則是,嚴(yán)重肌肉萎縮的患者,選病變相對(duì)輕的部位,因?yàn)樯窠?jīng)肌肉病晚期肌纖維被脂肪結(jié)締組織取代,難以作出診斷;病情比較輕的患者選癥狀最重的部位。同時(shí)注意避開表皮血管和皮膚損傷處。常用的肌肉活檢部位為:肱二頭肌、脛骨前肌、腓腸肌、股四頭肌,少數(shù)采用肱三頭肌、三角肌、崗上肌。也有骨科手術(shù)臨近部位如脊柱畸形矯正術(shù)取棘旁肌、胸外科手術(shù)取的肋間肌等。一般來講,以近端無力為主的肌肉疾病選取肢體近端肌肉活檢,如多發(fā)性肌炎、進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良,而遠(yuǎn)端受累為主的神經(jīng)肌肉病常選脛骨前肌,因?yàn)槭肿愣酁樯窠?jīng)肌腱集中的地方,容易造成功能損害,所以很少有人選取手足肌肉做病理檢查。常用于肌肉注射的部位不宜做肌肉活檢,如臀肌和三角肌,另外,術(shù)前肌電圖針刺部位也不宜活檢,所以如果想用肌電圖確定對(duì)稱性肌肉病的活檢部位時(shí),常用右側(cè)肌電圖檢查,把左側(cè)可能用的肌肉留出來。此外,應(yīng)避免在靠近肌腱處進(jìn)行活檢,因此處肌纖維常與結(jié)締組織混雜交織存在,且內(nèi)核肌纖維多,電鏡下見Z線扭曲等變化,易誤診為強(qiáng)直性肌病。超聲檢查是一種簡(jiǎn)單、快捷的評(píng)估肌肉病變程度的技術(shù),可以協(xié)助活檢部位的選擇。肌肉磁共振對(duì)不同疾病具有更高的圖像清晰度,能更好地反映病變改變規(guī)律,但是價(jià)格不菲,超聲檢查是更快速和實(shí)用的方法。2.2肌肉注射和針刺活檢常規(guī)消毒,鋪洞巾。局部麻醉:2%利多卡因5ml,加1滴腎上腺素,可以減少術(shù)野出血。注意麻醉藥不能注入肌肉。切口長(zhǎng)度:2～3cm,脂肪層厚的患者切口適當(dāng)加長(zhǎng),鈍性分離皮下組織至深筋膜,切開,分離并充分暴露肌肉組織,確定沒有大血管、神經(jīng)進(jìn)入肌束,用彎止血鉗輕柔挑取肌束,取直徑0.5cm,長(zhǎng)1cm的肌肉(避免肌肉過度牽拉),紗布?jí)浩戎寡?分層縫合深筋膜和皮膚,無菌紗布及彈力繃帶加壓包扎(可以防止術(shù)野滲血,但要在3h后放松,避免包扎部位遠(yuǎn)端腫脹)。針刺活檢常用于小兒或診療過程中的重復(fù)活檢,僅限于肌肉量多、危險(xiǎn)性低的股四頭肌。國(guó)內(nèi)同行很少采用,故不在此贅述。2.3樣品處理方法2.3.1冷凍肌肉組織標(biāo)本將所取肌肉標(biāo)本用耦合劑垂直固定在準(zhǔn)備好的硬紙板上。在液氮中預(yù)冷異戊烷,不斷攪拌至其出現(xiàn)白色結(jié)晶表示冷凍完全。然后用大鑷子把固定在硬紙板上的肌肉組織標(biāo)本快速放入冷卻的異戊烷中,并小心左右晃動(dòng)組織塊,冰凍約2min,使組織塊迅速充分凍結(jié)后放入液氮中(標(biāo)本可在液氮庫或-80℃或-160℃冷凍條件下可長(zhǎng)期保存)。-20℃～-25℃恒冷冰凍切片連續(xù)切片,厚度為8～10μm。2.3.2電鉻樣品處理取1mm×1mm×1mm肌肉樣品,可以多留取幾塊,置事先預(yù)冷的2.5%戊二醛內(nèi)4℃保存,樹脂包埋前鋨酸后固定。2.3.3生物化學(xué)研究因代謝異常導(dǎo)致的肌病最終需要生化數(shù)據(jù),取材同時(shí)需留取100～200mg密封保存在-80℃冰柜中。2.3.4永久性樣品用于保存剖檢得到的標(biāo)本,臨床病理診斷目前多采用冰凍切片,如有特殊需要,可將剩余的冰凍組織石蠟包埋保存。2.4一般染色方法2.4.1pahs和pas染色蘇木精-伊紅染色(HE)、改良Gomori三色染色(MGT)、輔酶Ⅰ-四氮唑還原酶染色(NADH-TR)、腺苷三磷酸酶染色(ATPase)、細(xì)胞色素C氧化酶染色(COX)、琥珀酸脫氫酶染色(SDH)、細(xì)胞色素酶和琥珀酸脫氫酶雙重染色(SDH/COX)、非特異酯酶染色(NSE)、糖原PAS染色(PAS)、堿性磷酸酶染色(AKP)、酸性磷酸酶染色(ACP)、油紅O染色(ORO)等。2.4.2表面織構(gòu)相關(guān)抗體與肌膜蛋白缺陷相關(guān)的抗體有:抗肌萎縮蛋白(dystrophin)、肌聚糖蛋白(sarcoglycans)、dysferlin、caveolin-3、層粘連蛋白α2(lamininα2)、膠原蛋白Ⅵ(collagenⅥ)等。與核蛋白缺陷相關(guān)的抗體有:伊默菌素(emerin)、核纖層蛋白A/C(laminA/C)等。與肌原纖維和細(xì)胞骨架蛋白缺陷相關(guān)的抗體有:肌球蛋白重鏈(myosinheavychain,MYHC)、myotilin、telethonin、肌聯(lián)蛋白(ttin)、伴肌動(dòng)蛋白(nebulin)、結(jié)蛋白(desmin)、網(wǎng)蛋白(plectin)等。3肌肉激活的適應(yīng)性和禁忌3.1肌肉活檢的檢查(1)凡是主訴肢體無力、肌肉萎縮或肢體肌肉疼痛者,在相關(guān)輔助檢查后仍不能確定病變性質(zhì)者;(2)其他系統(tǒng)的疾病,如血管炎、結(jié)節(jié)病或結(jié)締組織病累及肌肉者;(3)檢查發(fā)現(xiàn)肌酶升高,或肌電圖檢查顯示為肌源性損害者,經(jīng)征得患者及家屬同意即可肌肉活檢。必須肌肉活檢的疾病:先天性肌肉病、炎性肌肉病、代謝性肌肉病(線粒體肌病、糖元累積病和脂質(zhì)沉積病)。選擇性肌肉活檢的疾病:進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良、神經(jīng)源性肌萎縮。除肌肉疾病之外,伴有肌肉損害的其它疾病,如結(jié)節(jié)性動(dòng)脈周圍炎、肌陣攣性癲癇、Lafora病、蠟樣脂-脂褐素增多癥等,亦需要做肌肉活檢。一般不做肌肉活檢但需要與其他疾病鑒別時(shí)做:神經(jīng)肌肉接頭病(重癥肌無力)、離子通道病(周期性癱瘓)等。3.2肌肉激活的禁忌有出血傾向或手術(shù)部位有炎癥者不宜手術(shù)。糖尿病患者要慎重決定。4肌肉激活可以解決這些問題石蠟切片不能做酶組化檢查,只能診斷炎癥性肌肉病和結(jié)締組織病,可以用于剖檢病例組織不夠新鮮時(shí),一般已不用于臨床診斷。4.1肌纖維類型的檢測(cè)有10余種染色方法,其中最基礎(chǔ)的是HE染色,可以評(píng)價(jià)肌肉萎縮的程度,如萎縮肌纖維多呈圓形,呈鑲嵌狀分布者多為肌源性肌病;而出現(xiàn)小角化纖維,呈簇狀分布的多為神經(jīng)源性肌病。肌束周圍肌萎縮是多發(fā)性肌炎特別是皮肌炎的特點(diǎn)。HE染色可以觀察肌膜核的改變。肌膜核增加可見于強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良;固縮核聚集(pyknoticnuclearclump)多見于神經(jīng)源性肌病。觀察壞死及再生纖維的分布和數(shù)量。觀察肌纖維內(nèi)空泡的分布,如果所有的肌纖維都有空泡,常為組織凍結(jié)過程中的偽像;大量比較均勻的空泡出現(xiàn)在Ⅰ型纖維時(shí),高度懷疑脂代謝異常肌病;見到大小不同的明亮空泡時(shí),糖原病的可能性大,有些空泡內(nèi)含有嗜堿性物質(zhì),是糖原貯積癥Ⅱ型(Pompe病)的診斷依據(jù);還可以見到慢性進(jìn)展的肌營(yíng)養(yǎng)不良時(shí)出現(xiàn)的肌纖維分裂(fibersplitting);輪狀纖維(ringfiber);強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良見到的肌漿塊(sarcoplasmicmass)。觀察肌間質(zhì)血管周圍有無炎細(xì)胞浸潤(rùn),肌梭、肌膜及神經(jīng)終末的改變。MGT易于發(fā)現(xiàn)桿狀體肌病胞體內(nèi)的異常桿狀體,而在HE染色中是不能發(fā)現(xiàn)的。還能見到遠(yuǎn)端型肌病中的特征性改變鑲邊空泡(rimmedvacuole)。也可以看到破碎紅纖維(raggedredfiber)-診斷線粒體肌病的重要線索,需進(jìn)一步電鏡證實(shí)有無線粒體內(nèi)異常包涵體。NADH-TR可以確定肌纖維類型觀察到肌原纖維網(wǎng)的異常。靶和靶樣纖維多見于神經(jīng)源性肌萎縮;中央軸空病可見到多數(shù)肌纖維中心部位空芯;肌源性肌病可見肌纖維內(nèi)不規(guī)則形狀的低活性部分,稱蟲噬樣改變。HE、MGT和NADH-TR3種染色是診斷神經(jīng)肌肉病的最基本方法,3種染色1h內(nèi)可以完成,在此基礎(chǔ)上,再加用其他相關(guān)染色,更有針對(duì)性。SDH、COX染色可以作為NADH-TR的補(bǔ)充,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)線粒體的異常。ACP染色顯示高活性的是壞死纖維中的巨噬細(xì)胞、自噬反應(yīng)細(xì)胞(糖原?、蛐秃丸傔吙张?、再生纖維、蠟樣脂褐素沉積癥的蓄積物。是診斷炎癥性肌病、糖原病和蠟樣脂褐素沉積癥非常有用的方法。PAS染色是細(xì)胞內(nèi)糖原貯積的糖原病和多糖體貯積性疾病的診斷必需的。ORO染色對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂肪貯積的脂肪代謝異常性肌病(lipidstoragemyopathy)的診斷有特征性。ATPase染色是區(qū)分肌纖維類型的最佳方法?？梢园l(fā)現(xiàn)肌纖維類型的分布異常。除了診斷明確的神經(jīng)源性肌病之外,其他基本只要1型纖維超過55%,就可稱為1型纖維優(yōu)勢(shì)。這種病理改變最常見于先天性肌病(中央軸空病、桿狀體肌病、肌管性肌病、先天性肌纖維類型不均衡)。ATPase染色還可以判定萎縮肌纖維的類型,不同pH值染色可以清楚區(qū)分1、2型肌纖維,2型纖維中還可以分為2A、2B和2C纖維。2B纖維缺乏多見于進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良、先天性肌病和代謝性肌病。2C纖維大量出現(xiàn)具有臨床意義,見于以下3種情況:a.未成熟肌纖維的殘存;b.再生肌纖維;c.在神經(jīng)源性疾病中神經(jīng)再支配旺盛的肌肉,在肌纖維群組化的同時(shí)可以見到大量的2C纖維。染色方法較為麻煩,常用于肌病的研究。AKP染色可以判定再生初期的纖維。NSE染色用于顯示神經(jīng)肌肉接頭處,確定運(yùn)動(dòng)終板的存在,失神經(jīng)的小角化纖維濃染。AChE染色可以特異性染出神經(jīng)肌肉接頭,但臨床很少用。肌肉活檢常規(guī)組織化學(xué)和酶組織化學(xué)染色可對(duì)神經(jīng)肌肉病作出初步的分類,如神經(jīng)源性損害、肌源性損害、肌營(yíng)養(yǎng)不良、炎癥性肌病、線粒體肌病、脂質(zhì)沉積病、糖原累積病、先天性肌病等。4.2肌營(yíng)養(yǎng)不良類型在常規(guī)組織化學(xué)和酶組織化學(xué)染色基礎(chǔ)上,肌肉的分子病理診斷是通過免疫組織化學(xué)方法對(duì)肌病做進(jìn)一步的分類診斷,如進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良的各種亞型。Dystrophin可以診斷DMD和BMD;Sarcoglycans和Dysferlin可用來診斷肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良;Emerin可用于診斷Emery-Drifuss型肌營(yíng)養(yǎng)不良等。分子病理學(xué)研究的成就在不斷改變我們對(duì)肌病的診斷路徑。常規(guī)的組織學(xué)和酶組織化學(xué)染色已經(jīng)不能滿足診斷的需要,必須采取針對(duì)不同蛋白的免疫組織化學(xué)檢查。4.3臨床基因檢查中的基因功能檢查已為廣大民眾所關(guān)注,對(duì)某些已知基因突變的肌病進(jìn)行篩查,可為遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供參考。在部分肌營(yíng)養(yǎng)不良、周期性癱瘓、線粒體病、神經(jīng)肌肉接頭病和先天性肌病診斷中發(fā)揮更重要的作用。但由于基因突變的多樣性和檢測(cè)手段及費(fèi)用的限制,臨床基因檢查在目前只能解決具有熱點(diǎn)突變的遺傳性肌病的診斷,許多遺傳性肌病還需要確定其熱點(diǎn)突變。多數(shù)情況下發(fā)現(xiàn)致病突變可以診斷疾病,而陰性的結(jié)果不能排除診斷。在此基礎(chǔ)上,尚需要進(jìn)一步分析相關(guān)基因所編碼蛋白具有哪些功能以及在基因突變后的功能改變。同時(shí),需要研究不同基因突變后采取哪些治療更有幫助。4.4現(xiàn)代化技術(shù)在肌肉病理改變中的應(yīng)用電鏡檢查對(duì)線粒體肌病、糖原