二仙湯及其組方中藥對大鼠腎上腺雌激素受體表達(dá)的影響

二仙湯及其組方中藥對大鼠腎上腺雌激素受體表達(dá)的影響

二仙湯是著名的張伯納教授在20世紀(jì)中期創(chuàng)立的方劑。它主要用于治療腎陽虛證引起的疾病，如閉經(jīng)綜合征和其他腎陽虛證。它可以加熱和補(bǔ)充腎陽，改善體內(nèi)的雌激素分泌。體內(nèi)產(chǎn)生雌激素的器官有卵巢、腎上腺和胎盤。因此,在絕經(jīng)后的婦女中,雖然卵巢功能已衰退,但體內(nèi)仍可檢測到一定量的雌激素。已有研究表明,雌激素主要通過雌激素受體(ER)發(fā)揮作用,ER在不同組織分布、數(shù)量、種類不同。本實(shí)驗(yàn)通過觀察二仙湯及其組方中藥對幼年大鼠腎上腺ER的影響,探討二仙湯的植物雌激素樣作用,為二仙湯應(yīng)用于圍絕經(jīng)綜合征的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1實(shí)驗(yàn)材料1.1實(shí)驗(yàn)動物scxkSD雌性未成年正常大鼠54只,出生后21d(剛斷乳),體重50~60g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物中心,合格證號:SCXK京(2007-0001)。實(shí)驗(yàn)期間飼喂在二級動物室,溫度(25±1)℃。1.2二仙湯、仙茅、巴樣品淫羊藿、仙茅、巴戟天、當(dāng)歸、黃柏、知母6味中藥為免煎顆粒劑,首創(chuàng)大地藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。蒸餾水溶解,6味中藥分別配制成原藥材含量為0.1g/mL藥液;二仙湯按淫羊藿、仙茅、巴戟天∶當(dāng)歸、黃柏、知母為3∶2配制成原藥材含量1g/mL藥液;陽性藥物為己烯雌酚(批號20080104),0.5mg×100片/瓶,合肥久聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)。以上藥物均購自北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院。1.3ntacruz公司一抗:ERα(MC-20)和ERβ(H-150)為SantaCruz公司產(chǎn)品;過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素染色試劑盒(SP-9001)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;血清睪酮(T)檢測試劑盒購自北京華英生物技術(shù)研究所。2實(shí)驗(yàn)方法2.1實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)及分組將實(shí)驗(yàn)動物按體重均衡和隨機(jī)的原則分為9組:正常對照組、陽性對照組、二仙湯組以及6個單味藥組。實(shí)驗(yàn)動物適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后開始實(shí)驗(yàn)。正常對照組給予等體積蒸餾水;陽性對照組按0.18mg/(kg·d)給予己烯雌酚;二仙湯組按7.5g/(kg·d)給藥;淫羊藿、仙茅、巴戟天組按1.5g/(kg·d)給藥;當(dāng)歸、黃柏和知母組按1.0g/(kg·d)給藥。灌胃分早、晚2次進(jìn)行,給藥均持續(xù)6d。2.2血清樣品的制備給藥6d,處死前禁食12h。用10%水合氯醛按4mL/kg腹腔注射麻醉,沿大鼠腹正中線打開腹腔,自腹主動脈取血,經(jīng)室溫靜置2h后,3000r/min離心10min,取其上清液,分別保存于EP管中,-20℃保存?zhèn)溆?。將腎上腺與周圍組織完全剝離后取出,稱重,用中性甲醛固定后制成石蠟切片。2.3血清中醇的測定具體步驟參照所購試劑盒說明書。2.4大鼠er或er抗體檢測石蠟切片脫蠟至水,微波修復(fù)抗原10min;入3%過氧化氫室溫孵育30min;正常山羊血清封閉液室溫孵育20min,傾去,分別用兔抗大鼠ERα或ERβ抗體(1∶150,SantaCruz)孵育切片(4℃,過夜);羊抗兔二抗37℃孵育30min,辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液37℃孵育30min,DAB染色。每步驟間用0.O1mol/LPBS充分洗滌,常規(guī)脫水,透明,封片,光鏡下觀察,攝片。染成棕黃色顆粒者為陽性。陰性對照采用PBS代替一抗孵育切片。2.5檢測抗體表達(dá)量采用通用醫(yī)學(xué)圖像分析儀,光鏡下觀察各組染色結(jié)果,用NIS-ElementsBasicResearch數(shù)據(jù)分析軟件分析相應(yīng)抗體的表達(dá)量,每組取6張切片,每張切片取5個視野,計算每視野陽性染色平均光密度值(MeanOpticalDensity,MOD)。3統(tǒng)計方法所有統(tǒng)計資料用—x±s表示,統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS11.5軟件,單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。4結(jié)果4.1各組大鼠肝腎皮質(zhì)中er、tdb的表達(dá)情況采用免疫組織化學(xué)法檢測。ERα在各組大鼠的腎上腺皮質(zhì)中均有表達(dá),而在髓質(zhì)中則未見表達(dá),主要表達(dá)于腎上腺皮質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)中,以球狀帶和束狀帶為主,呈深棕黃色顆粒狀,網(wǎng)狀帶亦有表達(dá),呈淺黃色顆粒狀。ERβ主要表達(dá)于各組大鼠的腎上腺皮質(zhì)的細(xì)胞核中,而在髓質(zhì)中未見表達(dá)。以球狀帶和束狀帶為主,呈深棕黃色,網(wǎng)狀帶亦有表達(dá),呈淺黃色。結(jié)果見表1。4.2影響腎臟系數(shù)和血清睪酮的因素見表25植物激素er組織化學(xué)法檢測,主要分為三大組織和三大支撐體系腎上腺是體內(nèi)的一對重要的內(nèi)分泌腺。在組織學(xué)上,腎上腺由周圍的皮質(zhì)和中央的髓質(zhì)構(gòu)成。皮質(zhì)根據(jù)組成細(xì)胞的排列方式和功能的不同由外向內(nèi)依次為球狀帶、束狀帶、網(wǎng)狀帶。網(wǎng)狀帶可分泌一定量的雄烯二酮,通過芳香化酶轉(zhuǎn)化為雌酮,也可被17β-醇甾-脫氫酶轉(zhuǎn)化成睪酮,睪酮再被芳香化成為雌二醇。本實(shí)驗(yàn)采用腎上腺系數(shù)而非腎上腺濕重,旨在消除大鼠體重因素產(chǎn)生的誤差。結(jié)果發(fā)現(xiàn):陽性對照組、二仙湯組腎上腺系數(shù)均增加。對血清T水平的影響,二仙湯組降低最明顯,方中溫腎藥(淫羊藿、仙茅)和滋陰瀉火藥(知母)亦使T水平降低。因此,我們推測是否與植物雌激素的作用機(jī)制有關(guān)。雌激素是類固醇激素,透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)ER上的配體結(jié)合區(qū)結(jié)合,并使受體二聚體化,結(jié)合后的復(fù)合物穿過核膜,在核內(nèi),ER上的DNA結(jié)合區(qū)與靶基因啟動子上的雌激素應(yīng)答元件結(jié)合,從而啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄,從而加速蛋白質(zhì)的合成,使細(xì)胞增生。在我們的研究中,應(yīng)用免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn)ERα主要分布于腎上腺皮質(zhì)球狀帶和束狀帶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中,其中全方組表達(dá)量明顯升高,因此,全方組腎上腺系數(shù)增加。而陽性組雖然ERα表達(dá)量明顯下降,但其系數(shù)亦明顯升高,可能是己烯雌酚發(fā)揮作用的途徑與機(jī)制與植物雌激素不同,還需進(jìn)一步研究。ERβ主要位于腎上腺皮質(zhì)球狀帶和束狀帶細(xì)胞的細(xì)胞核,網(wǎng)狀帶亦有少量分布,這與薛氏等研究結(jié)果相一致。與陽性對照組比較,全方組、淫羊藿組、仙茅組和知母組均降低,進(jìn)一步推測己烯雌酚與植物雌激素作用機(jī)制的可能不一致。KuiperGG等研究表明,植物雌激素對ERβ的親和力遠(yuǎn)高于ERα。另外,BrookesJD