植物生物技術：第五章-單倍體細胞培養(yǎng)課件

第五章 單倍體細胞培養(yǎng)第五章1第一節(jié) 單倍體及其應用價值第二節(jié) 離體花粉/小孢子發(fā)育途徑第三節(jié) 花藥培養(yǎng)與花粉培養(yǎng)第四節(jié) 植物單倍體育種本章主要內容第四章2本章教學目的與要求概念：花粉培養(yǎng)，花藥培養(yǎng)，花粉二型性單倍體的應用價值離體花粉的發(fā)育途徑花粉培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)的比較第四章34第一節(jié) 單倍體及其應用價值一、概念二、單倍體的起源三、單倍體植物的特點及遺傳行為四、單倍體的應用價值第五章一、概念單倍體是指具有配子染色體數(shù)的個體或組織，體細胞染色體數(shù)為n單倍體細胞培養(yǎng)主要包括三個方面：花藥培養(yǎng)花粉培養(yǎng)未受精子房及卵細胞培養(yǎng)第一節(jié)5二、單倍體的起源①

種間和屬間雜交

遠緣雜交中，異種植物雖然不能與母本授粉、受精，由于遠緣花粉的誘導作用，卵細胞在沒有受精的情況下受刺激而發(fā)育成胚土豆、大麥、小麥、玉米②

物理照射和化學誘變

花粉用射線照射后失去了受精能力，然后與母株授粉，卵細胞在花粉的刺激作用下進行孤雌發(fā)育，從而產生單倍體煙草、小麥、金魚草第一節(jié)6③ 雙生苗的篩選（selection

of

twins）有些植物可產生多胚種子，即兩個或多個胚被共同的種皮包裹著，這些種子可產生單倍體-單倍體、二倍體-二倍體和單倍體-二倍體植株在辣椒中，雙生苗的頻率受母本基因型控制通過篩選可以提高雙生苗的頻率④花藥和花粉培養(yǎng)第一節(jié)7三、單倍體植物的特點及遺傳行為1、單倍體分成兩類:一倍單倍體（monohaploids），這類單倍體起源于二倍體物種多倍單倍體（polyhaploids），這類單倍體起源于多倍體（如4X，6X等）第一節(jié)8diploid 植物其haploid即為monoploid玉米2n=2x=20n=x=10水稻2n=2x=24n=x=12柑橘2n=2x=18n=x=9tetraploid植物其haploid為dihaploid馬鈴薯

2n

=

4x

=

48

n

=

2x

=

24陸地棉

2n

=

4x

=

52

n

=

2x

=

26hexaploid植物其haploid為triploid普通小麥2n

=

6x

=

42

n

=

3x

=

21octoploid植物其haploid為tetraploid草莓

2n

=

8x

=

56

n

=

4x

=

28第一節(jié)92、單倍體植物的特點體細胞染色體數(shù)減半；生長發(fā)育弱，體形小、各器官明顯減小；雌雄配子嚴重敗育，有的甚至不能進入有性世代3、單倍體的遺傳行為一倍的單倍體只有一個染色體基數(shù)（X），減數(shù)分裂時染色體不能配對，分離極不正常但具有一定同源關系的染色體可以部分配對，從而可以對染色體的演化過程進行研究第一節(jié)1011四、單倍體的應用價值母本×父本F1F2花藥培養(yǎng)花粉植株加倍選擇鑒定品系比較試驗區(qū)域試驗品種5—8代（一）、縮短育種周期第一節(jié)（二）、提高目標基因型的選擇效率12如果某一性狀受一對基因控制–AA×aa→F1→F2中純合AA個體只有1/4–F1采用花藥或花粉培養(yǎng)，產生的后代中AA個體占1/2，比常規(guī)雜交育種提高一倍如屬兩對基因控制–AAbb×aaBB,

F2中要選出AABB個體的機率只有1/16–F1采用花藥或花粉培養(yǎng)，AaBb只產生4種花粉：AB、Ab、aB、ab，加倍后

AABB個體的頻率可達1/4–比常規(guī)雜交育種效率提高4倍常規(guī)育種：單倍體育種=1/22n：1/2n。（三）、排除雜種優(yōu)勢對后代選擇的干擾對于雜交育種來講，由于低世代很多基因位點尚處于雜合狀態(tài)，會有不同程度的雜種優(yōu)勢表現(xiàn)，對個體的選擇會造成一定誤差采用DH群體進行選擇育種，由于各基因位點在理論上均處于純合狀態(tài)，選擇到的變異能更大程度上代表真實變異第一節(jié)13（四）、遺傳研究的良好實驗材料體系單倍體在作物的數(shù)量遺傳研究中可能有較大用途，如：基因相互作用的檢測、遺傳變異的估計、連鎖群的檢測、影響數(shù)量性狀的基因數(shù)目的估計及多基因的定位等DH系是分子標記遺傳作圖的良好群體單倍體可用來創(chuàng)造非整倍體材料，用單倍體與二倍體雜交，可創(chuàng)造一系列的附加系，從而研究染色體的遺傳功能花藥和花粉培養(yǎng)體系還是發(fā)育遺傳研究的良好材料，可以用來研究細胞的分裂及分化，研究花粉發(fā)育途徑的轉變，以及與轉變有關的基因的表達與調控第一節(jié)14（五）、突變體的篩選單倍體的每個基因都是單拷貝的，各種隱性基因都可以表現(xiàn)出來，加

倍后形成的雙單倍體各基因均處于純合狀態(tài)，突變體很容易表現(xiàn)出來，大大提高了抗性或其它突變體的篩選效率對花藥進行離子照射，然后對花藥愈傷篩選，可以獲得理想的突變體第一節(jié)15（六）、消除致死基因單倍體帶有致死基因的個體即使加倍后形成雙單倍體也會由于基因的純合而被消除而致死基因在自然群體里常常因為雜合體的存在而不易被徹底消除。（七）、選育新型自交系對雙親或多親雜交的雜種一代進行花藥或花粉培養(yǎng)，獲得的雙單倍體實際上是純合的自交系，在雜種優(yōu)勢利用育種中有很大用途第一節(jié)16（八）、遺傳轉化的受體材料在轉基因育種中，如果用體細胞為受體，經(jīng)常遇到轉基因后代材料分離問題，經(jīng)多代選擇才能穩(wěn)定下來如用單倍體細胞作受體，獲得的轉基因材料經(jīng)加倍后，從理論上講會很快達到純合狀態(tài)受體材料可以是花粉、單倍體原生質體、單倍體胚或單倍體植株作外植體第一節(jié)本節(jié)完17第二節(jié) 離體花粉/小孢子發(fā)育途徑一、花粉/小孢子的正常發(fā)育階段二、離體小孢子的發(fā)育途徑三、雄核發(fā)育啟動機理第二節(jié)18一、花粉/小孢子的正常發(fā)育階段19（一）、花粉不均等分裂途徑(A途徑

)小孢子第一次有絲分裂為不均等分裂，形成營養(yǎng)細胞和生殖細胞。營養(yǎng)細胞發(fā)育途徑:由營養(yǎng)細胞重復分裂形成單倍體生殖細胞發(fā)育途徑:由生殖細胞重復分裂形成單倍體營養(yǎng)細胞和生殖細胞并進發(fā)育途徑:由營養(yǎng)細胞和生殖細胞各自獨立分裂，共同形成單倍體營養(yǎng)細胞和生殖細胞通過核融合，形成多倍體植株二、離體小孢子的發(fā)育途徑第二節(jié)2021第二節(jié)（二）花粉均等分裂途徑（B途徑）小孢子第一次有絲分

裂為均等分裂，形成

大小相近的兩個細胞。然后由這兩細胞繼續(xù)

分裂形成單倍體植株，或者核融合形成多倍

體植株221、雄核發(fā)育與P花粉的形成花粉的二型性：在花藥/花粉培養(yǎng)時，由于對培養(yǎng)條件的反應不同，花粉在形態(tài)上形成兩種類型，一類是具胚性的，在煙草和大麥中，花粉小，染色淺；另一類為花粉大，染色深，朝成熟花粉方向發(fā)展P-花粉：具胚胎發(fā)生潛能的花粉。也稱小花粉（S-花粉）或不染色花粉（NS-花粉）三、雄核發(fā)育啟動機理第二節(jié)23在煙草和大麥中，花粉小，染色淺，為胚性的胚性小孢子第三節(jié)24水稻花粉二型性在水稻中，胚性小孢子（約10%）比非胚性小孢子大、高度液泡化胚性小孢子第三節(jié)252、逆境處理與雄核發(fā)育的誘導熱激處理物理或化學處理低溫處理營養(yǎng)饑餓處理重金屬脅迫激發(fā)花粉產生原胚促使細胞同步分裂改變細胞分裂周期第二節(jié)本節(jié)完第三節(jié) 花藥培養(yǎng)與花粉培養(yǎng)一、花藥培養(yǎng)操作技術二、花粉培養(yǎng)操作技術三、單倍體植株再生、鑒定及加倍四、花粉培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)的比較五、影響花藥培養(yǎng)的因素六、禾本科植物花藥培養(yǎng)中的白化苗現(xiàn)象第三節(jié)26花藥培養(yǎng):是植物雄性生殖器官-花藥為外植體離體培養(yǎng)技術，就培養(yǎng)方法和技術來講，屬于器官培養(yǎng)的范疇。花粉培養(yǎng)：將處于一定發(fā)育階段的花粉從花藥中分離出來，再加以離體培養(yǎng)。也稱為小孢子培養(yǎng)(microspore

culture)27一、花藥培養(yǎng)操作技術1、取材鏡檢，根據(jù)花粉的發(fā)育時期，選取大小適宜的花蕾。2、消毒

70％酒精浸泡30-60s花蕾后在1％次氯酸鈉溶液中浸泡10-20min，無菌水沖洗3-5次。3、培養(yǎng) 固體或液體培養(yǎng)基均可。先進行脫分化培養(yǎng)，至小孢子大量分裂形成胚或愈傷，并突破花藥壁表面，形成突出物（2-3周）；后轉入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，形成小植株。第三節(jié)28二、花粉培養(yǎng)操作技術(一)花粉的分離與純化1、自然散落法(漂浮培養(yǎng)散落小孢子收集法)將花藥接種在預處理液或液體培養(yǎng)基上，待花粉自動散落后，收集培養(yǎng)。2、擠壓法 在燒杯或研缽中擠壓花藥，將花粉擠出后收集培養(yǎng)。3、機械游離磁攪拌法：用磁力攪拌器攪拌培養(yǎng)液中的花藥，使花粉游離出來；超速旋切法：通過攪拌器中的高速旋轉刀具破碎花蕾、穗子、花藥，使小孢子游離出來（此法應用最廣）。4、小孢子純化 對上述方法獲得的小孢子混合物進行分級過篩、梯度離心處理純化小孢子第三節(jié)29(二)花粉培養(yǎng)方式1、平板培養(yǎng)：花粉置瓊脂固化培養(yǎng)基上培養(yǎng)。2、液體培養(yǎng)：花粉懸浮在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，需震蕩，以利通氣。3、雙層培養(yǎng)：花粉置固體-液體雙層培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)基制作方法：先鋪一層瓊脂固體培養(yǎng)基，凝固后，在表面加入少量液體培養(yǎng)基。4、看護培養(yǎng)：利用花藥或花藥愈傷組織釋放出的活性物質促進花粉小孢子發(fā)育。5、微室培養(yǎng)：利用小的蓋玻片和凹穴載玻片形成微室進行花粉培養(yǎng)6、條件培養(yǎng)基培養(yǎng)：利用培養(yǎng)過花藥的液體培養(yǎng)基或含失活花藥提取物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)?；ㄋ帡l件培養(yǎng)基、子房條件培養(yǎng)等。第三節(jié)30看護培養(yǎng)：第三節(jié)31（一）花粉植株的形態(tài)發(fā)生方式1、器官發(fā)生型花粉-----多細胞花粉粒----細胞團（愈傷組織）-----繼代培養(yǎng)-----單倍體植株。2、胚狀體發(fā)生型花粉-----多細胞花粉粒----進一步培養(yǎng)----胚狀體-----釋放-----植物體。第三節(jié)32三、單倍體植株再生、鑒定及加倍第三節(jié)33（二）、單倍體植株鑒定1、染色體直接計數(shù)法：通常取根尖、莖尖等分生組織區(qū)進行制片，直接計數(shù)染色體數(shù)目。2、間接鑒定流式細胞儀鑒定：主要測定葉片單個細胞中DNA的含量確定細胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。細胞形態(tài)學鑒定法：葉片保衛(wèi)細胞大小、單位面積上的氣孔數(shù)及保衛(wèi)細胞中葉綠體的大小和數(shù)目與倍性具有高度的相關性。第三節(jié)34（3）植株形態(tài)學鑒定法：單倍體植株瘦弱，葉片窄小，花小柱頭長，花粉粒小，不結實。雜交鑒定法：自交或測交鑒定，看后代分離情況確定二倍體植株是來自小孢子還是體細胞。分子標記鑒定 如RFLP、RAPD、AFLP等第三節(jié)35（三）、染色體加倍

莖段培養(yǎng)：將單倍體植株的莖段進行培養(yǎng)，誘導愈傷組織形成。由于單倍體愈傷組織在培養(yǎng)過程中會有一定頻率的核內有絲分裂，從而形成二倍體細胞，分化出純合的二倍體植株?；瘜W試劑誘變：秋水仙素誘導浸泡法：無菌條件下以一定濃度的秋水仙素浸泡再生小植株，再轉移至新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。生長錐處理：秋水仙素水溶液直接涂抹生長點（頂芽或腋芽）。培養(yǎng)基處理：將單倍體植株和任何一部分作為外植體，種植在附加一定濃度和秋水仙素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后，轉入無秋水仙素的相同培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)誘導胚狀體。第三節(jié)36花藥和花粉培養(yǎng)基本流程：選擇合適的供體植株（F1）預處理花藥（物理或生理逆境）收集具胚性小孢子的花藥，或離心收集胚性小孢子培養(yǎng)（充足的營養(yǎng)、合適的溫光、或條件培養(yǎng)）形成胚狀體胚狀體轉移至固化培養(yǎng)基上”萌發(fā)”形成小植株。倍性鑒定或染色體加倍第三節(jié)37四、花粉培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)的比較第三節(jié)38花藥培養(yǎng)有時會由于花藥中的有害物質而不能誘導小孢子啟動第一次分裂，小孢子培養(yǎng)則不會花粉已是單倍體細胞，誘發(fā)都是單倍體植株或雙單倍體，不含有因藥壁、花絲、藥隔等體細胞組織的干擾而形成的體細胞植株花粉培養(yǎng)獲得的材料總是純合的由于花粉能均勻地接觸化學的和物理的誘變因素，花粉是研究吸收、轉化和誘變的理想材料可觀察到由單個細胞開始雄核發(fā)育的全過程，是遺傳與發(fā)育研究良好的材料體系供體植株的生長條件煙草：短光周期（8h）和高光強（16000lux）大麥：低溫（12

℃ ）和高光強（20000lux）油菜：高光強和一定的溫度變化2.

供體植株的年齡多數(shù)情況下幼年植株優(yōu)于老年植株第三節(jié)39五、影響花藥培養(yǎng)的因素3.

花粉發(fā)育時期花粉發(fā)育時期對誘導雄核發(fā)育非常重要一般從單核早期到雙核早期第三節(jié)發(fā)育時期

減數(shù)分裂期四分孢子期單核早中期單核晚期單核早期至晚期40物種草莓、番茄葡萄大麥、天仙子、馬鈴薯

荔枝、茄子、青椒、小麥煙草梨、水稻、甘藍單核早期至雙核期41花粉發(fā)育時期的確定花藥在接種以前，一般需先用醋酸洋紅壓片法進行鏡檢，以確定花粉的發(fā)育時期，并找出花粉發(fā)育時期與花蕾或幼穗大小、顏色等特征之間的相應關系根據(jù)花蕾和花藥的長度判斷小孢子發(fā)育時期，從而為取材提供參考第三節(jié)單核晚期第一次有絲分裂后期雙核早期雙核中期4. 花蕾和花藥的預處理：低溫、EMS、秋水仙素、γ射線、酒精、高低滲、饑餓處理、高溫處理、重金屬脅迫等低溫預處理：煙草

3～5℃

72小時水稻

10℃

10～14天第三節(jié)425.

供體植株的基因型供體植株的基因型是影響花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)的關鍵因素不同基因型的植株對培養(yǎng)的反應不同表現(xiàn)為是否可誘導胚狀體的生成，生成胚狀體的多少，以及由胚再生成植株的能力大小第三節(jié)43基因型接種愈傷再生率（%）植株數(shù)/花藥花藥數(shù)產量綠苗率 白苗率綠苗數(shù)白苗數(shù) 綠苗/白苗Igri18010.5733.3316.673.521.672.0IgriHO42012.9230.643.233.960.429.4IgriH118022.1830.3018.186.724.031.7Atias

608.577.147.140.610.611.0No.1

G.N.12014.144.004.000.570.571.0Doublet18011.6615.007.501.750.872.0Harrington3002.1223.535.880.500.124.2Triumph2402.6266.6716.671.750.444.0Goft1801.1416.6711.110.190.131.5Wen

I2401.6310.0013.330.160.220.7Ht/Gm

F63002.8220.005.000.560.144.0No.3

Z.S/Igri

F124010.2014.2928.571.462.910.5G.M.R.T./Igri

F16012.5311.547.691.450.961.5Harrington/IgriF1

608.4033.3333.332.802.801.0Igri/Harry

F118038.6137.5016.6714.486.442.2Igri/J.Q.F112027.8756.2518.7515.685.233.0平均—11.55

24.6212.82

3.341.64—大麥基因型對花藥培養(yǎng)效果的影響反應差反應好第三節(jié)446.

培養(yǎng)基：①花藥培養(yǎng)常用的基本培養(yǎng)基種類MSNitschN6B5第三節(jié)45②滲透壓花藥培養(yǎng)時往往需要一定的滲透壓，成熟花粉是二細胞結構的，往往需低濃度糖成熟花粉為三細胞結構的植物往往需高滲條件，如油菜小孢子培養(yǎng)時，糖的濃度可用到13-17%番茄花藥培養(yǎng)對蔗糖濃度的誘導反應:蔗糖濃度

2％

3％

4％

6％

10％

13％

17％誘導頻率

5％

10％

12％

18％

25％

45％

8％第三節(jié)46③激素2，4-D對啟動分裂和愈傷的增殖往往有刺激作用，但對分化卻有抑制作用，在誘導單倍體愈傷分化時，應及時降低或去除2，4-D高濃度的2,4-D主要誘導花藥形成愈傷組織，增加了二倍體細胞發(fā)育的機會在茄子中的研究表明：MS＋2,4-D

0.5mgl-1＋KT

1mgl-1，n

-93.8%

，2n

-6.2%MS＋2,4-D

2mgl-1

＋

KT

1mgl-1，n

-64.1%

，2n

-35.9%第三節(jié)47④氮素的量和各種氮素的比例朱至清等（1974）在水稻花藥培養(yǎng)中改變培養(yǎng)基中無機氮源可以顯著改變花粉形成愈傷組織的頻率，隨后又能影響由愈傷組織分化綠苗的頻率在他們所研制的N6培養(yǎng)基中，供試的三個水稻品種花粉出愈率分別為

37.7%,32.2%和7.5%，而在Miller培養(yǎng)基上分別只有15.5%,10.8%和0%N6與Miller培養(yǎng)基中氮的組成有明顯不同為禾本科作物的花藥培養(yǎng)主要使用N6培養(yǎng)基第三節(jié)48⑤有機物質在大麥和小麥的花藥培養(yǎng)中，谷氨酰胺對小孢子胚形成具有明顯的促進作用對于某些植物種來講，添加某種植物的提取物或椰汁可以改善培養(yǎng)效果第三節(jié)49⑥有些作物的花藥對培養(yǎng)基的pH值有一定要求在曼陀羅的花藥培養(yǎng)中，觀察到隨著pH值的變化，產生胚