穿孔素的結(jié)構(gòu)、表達(dá)與調(diào)節(jié)機(jī)制及免疫調(diào)節(jié)作用

穿孔素的結(jié)構(gòu)、表達(dá)與調(diào)節(jié)機(jī)制及免疫調(diào)節(jié)作用

穿孔素（tcl）是一種存在于細(xì)胞毒性t細(xì)胞（ctl）和自然損傷細(xì)胞（nk）細(xì)胞血漿中的糖蛋白。近年來,有關(guān)PFP的研究日益活躍,對PFP蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、表達(dá)與調(diào)節(jié)機(jī)制、PFP介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)在抗感染免疫中的作用以及PFP的免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了廣泛深入的研究,本文就這些方面的研究進(jìn)展作一綜述。1egf分子的結(jié)構(gòu)變化和活性穿孔素是一種糖蛋白,結(jié)構(gòu)類似于補(bǔ)體C9,由534個(gè)氨基酸組成,N端的40個(gè)氨基酸和C端約100個(gè)氨基酸為PFP分子所獨(dú)有,成熟前在N端還含有一個(gè)由20個(gè)氨基酸組成的引導(dǎo)肽。N端的19個(gè)氨基酸具有與整個(gè)PFP類似的溶解靶細(xì)胞的活性,PFP分子內(nèi)部的190~203位氨基酸殘基能夠折疊成雙歧性的α螺旋結(jié)構(gòu),356~386位氨基酸殘基為富含半胱氨酸的EGF受體前體區(qū)域,388~519位氨基酸殘基折疊成由8個(gè)β片層組成的結(jié)構(gòu),末端是與δ磷脂酶C(PLC-δ)類似的C2功能區(qū)域,包含3個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn),能夠與靶細(xì)胞膜中的磷脂結(jié)合。C端的19個(gè)氨基酸殘基對于PFP的正確折疊后離開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)很重要,缺失這19個(gè)氨基酸殘基的PFP不能進(jìn)入分泌顆粒而留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。2il-2和tgf-穿孔素主要由成熟的NK和激活的CTL細(xì)胞合成和分泌,它的表達(dá)主要受細(xì)胞因子的調(diào)節(jié),這也是細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能的一個(gè)重要方面。多種細(xì)胞因子,包括IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-12和IFNs等都能夠增加PFP表達(dá)。rIL-2能在18~30h內(nèi)使外周血單個(gè)核細(xì)胞的PFPmRNA水平上升5倍。IL-2和IL-7通過誘導(dǎo)和活化NK細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化蛋白5a/b的異二聚體化與啟動(dòng)子中的STAT結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合而刺激PFP轉(zhuǎn)錄,IL-6則通過誘導(dǎo)STAT1α的合成而刺激轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)化生長因子(transforminggrowthfactor-β,TGF-β)可抑制PFP和顆粒酶的表達(dá)而降低細(xì)胞毒作用。同時(shí)穿孔素表達(dá)降低與感染的慢性化以及病毒的致病力都有關(guān)。在腫瘤發(fā)生發(fā)展及病毒感染的過程中,雖然CTL數(shù)目增加,但分泌穿孔素等物質(zhì)的能力卻大大減低。研究還顯示,HIV感染中CTL的穿孔素含量(即CTL分化程度)與艾滋病進(jìn)展程度有關(guān)。YangOO等的研究表明,HIV感染患者穿孔素和顆粒酶表達(dá)明顯減少,進(jìn)一步導(dǎo)致CTL的衰老和功能減低,從而使病情發(fā)展。3cd4+cd8+t間接殺傷靶細(xì)胞在體內(nèi),免疫毒性細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的途徑和機(jī)制主要有兩種:(1)FAS途徑經(jīng)死亡受體起作用。(2)毒性顆粒途徑。當(dāng)CTL和NK細(xì)胞受到抗原刺激后,效應(yīng)靶細(xì)胞識(shí)別,胞漿顆粒重定向,移至效應(yīng)靶細(xì)胞接觸部位,通過出胞作用以分泌性溶酶體形式將這些毒性顆粒釋放到細(xì)胞間隙。毒性顆粒成分主要包括穿孔素和顆粒酶。免疫毒性細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的途徑主要依賴于細(xì)胞類型,其次為靶細(xì)胞上FasL的表達(dá)及敏感程度等。在CTL中的CD8+T細(xì)胞幾乎完全依賴穿孔素和顆粒酶殺傷靶細(xì)胞和病原體,雙陰性的CTLs細(xì)胞毒性是FasL/Fas相互作用介導(dǎo)的,對病原體活力無影響,而CD4+CD8+T可通過任一途徑殺傷靶細(xì)胞。穿孔素被細(xì)胞分泌后,在Ca2+存在的條件下,PFP單體分子N端的β2折疊區(qū)域構(gòu)像首先發(fā)生變化,從而導(dǎo)致親水性的PFP分子的兩歧性(amphipathy)區(qū)域暴露而改變成兩歧構(gòu)像,從而能夠結(jié)合、插入感染細(xì)胞的細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層,通過所謂的“桶棍模型”,PFP單體以進(jìn)行性增添的方式形成不同直徑的小孔。10~20個(gè)單體才能聚合成一通道,這些通道的內(nèi)徑在5~20nm之間,內(nèi)側(cè)由單體的親水性氨基酸殘基構(gòu)成,疏水性殘基則向著磷脂雙分子層。該通道失去對離子通道的選擇性,可以令水分子、離子以及其他小分子物質(zhì)進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi),而大分子物質(zhì)流出細(xì)胞外,靶細(xì)胞內(nèi)滲透壓改變,細(xì)胞膨脹,細(xì)胞膜破裂導(dǎo)致細(xì)胞滲透性溶解(膜壞死)。同時(shí),顆粒酶B(GrB)通過PFP在靶細(xì)胞膜上形成的通道進(jìn)入靶細(xì)胞漿,在靶細(xì)胞漿內(nèi)再分布,集中于細(xì)胞核,在PFP的幫助下進(jìn)入細(xì)胞核,并嵌入DNA中啟動(dòng)凋亡機(jī)制使其發(fā)生程序性死亡(凋亡)。但是,PFP單獨(dú)作用引起的膜管型的損害并不一定引起細(xì)胞死亡,因?yàn)榘屑?xì)胞在受到PFP作用后即可啟動(dòng)細(xì)胞的修復(fù)程序,修復(fù)被PFP攻擊的膜從而避免細(xì)胞的壞死;如果在修復(fù)過程中靶細(xì)胞發(fā)生吞飲作用,將GrB小囊泡攝入,細(xì)胞還是會(huì)發(fā)生凋亡,此稱GrB的協(xié)同作用。在無PFP存在的情況下,GrB也能夠通過能量依賴途徑穿過細(xì)胞膜,進(jìn)入細(xì)胞漿內(nèi),但并不引起細(xì)胞的明顯損害,這是因?yàn)镻FP可引發(fā)凋亡和影響GrB向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移,這又稱作PFP協(xié)助下的內(nèi)解離(internaldisintegration),即PFP的間接殺傷功能。因此,雖然GrB不需要PFP的輔助也能夠自主進(jìn)入靶細(xì)胞,但是PFP對凋亡過程的起始和GrB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)起關(guān)鍵作用。4儒家思想的緩解4.1cd8+t細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證明穿孔素基因被剔除(perforinknockout,PKO)的小鼠在超抗原、病毒等刺激時(shí),抗原特異性CD8+T細(xì)胞擴(kuò)增加強(qiáng),清除延遲,而且不能用抗原提呈細(xì)胞(APC)功能減弱來解釋。NatalyaV等用免疫組化法證明在結(jié)核中穿孔素能調(diào)控CD8+CTL細(xì)胞的活性。這一切表明穿孔素介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用在體內(nèi)CD8+CTL細(xì)胞應(yīng)答中有自穩(wěn)調(diào)節(jié)作用,但具體機(jī)制目前還不清楚。4.2t細(xì)胞內(nèi)吞形成內(nèi)推HuangJF等實(shí)驗(yàn)表明,APC表面的抗原肽-MHC復(fù)合物(pMHCs)可轉(zhuǎn)移到特異性T細(xì)胞表面上,并通過TCR介導(dǎo)的內(nèi)吞作用內(nèi)化。當(dāng)抗原濃度較高時(shí),高密度的pMHCs轉(zhuǎn)移到特異性靶細(xì)胞表面被重新提呈后,可被已激活的CTL殺傷。4.3穿孔素調(diào)節(jié)apc的抗原提呈腫瘤gp96抗原是一種抗原性很強(qiáng)的抗原。試驗(yàn)證明PKO小鼠即使用腫瘤gp96抗原刺激,也不能導(dǎo)致NK細(xì)胞激活或CTL擴(kuò)增,說明穿孔素能夠調(diào)節(jié)APC的抗原提呈。同時(shí)還有試驗(yàn)證明腫瘤細(xì)胞可通過表達(dá)MHC-I類抗原,阻礙穿孔素/顆粒酶途徑,說明能夠調(diào)節(jié)APC的抗原提呈也就能夠調(diào)節(jié)CTL依賴的穿孔素的細(xì)胞毒作用。穿孔素和APC抗原提呈的負(fù)反饋調(diào)節(jié)可防止T細(xì)胞的過度活化并下調(diào)免疫應(yīng)答。4.4調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥活性PFP-鼠Ig增強(qiáng),穿孔素對自身免疫病易感動(dòng)物的保護(hù)作用都證明其對B細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用,具體機(jī)制不清楚。另外,穿孔素可調(diào)節(jié)其它殺傷顆粒成分的炎癥活性。CTL、NK殺傷顆粒中的顆粒酶A在細(xì)胞外具有促炎癥活性,可誘導(dǎo)人類肺成纖維細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-8。CTL受抗原刺激時(shí),30%的顆粒酶A被分泌到細(xì)胞外,穿孔素存在時(shí)主要誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡,穿孔素缺失時(shí)則超水平發(fā)揮炎癥活性,導(dǎo)致免疫病理損傷。5cd4+ctl的來源由于在抗感染、抗腫瘤及自身免疫中所起到的重要作用,穿孔素近年來十分被重視。目前對于穿孔素的認(rèn)識(shí)還很局限,許多問題有待解決,如穿孔素如何調(diào)節(jié)APC、B細(xì)胞及外周活化CTL細(xì)胞的功能;穿孔素如何參與CTL對活化的抗原特異性T細(xì)胞的直接殺傷過程;穿孔素如何調(diào)節(jié)其它殺傷顆粒成分的炎癥活性及穿孔素究竟來源于哪種細(xì)胞等。過去認(rèn)為穿孔素只是由NK和激活的CTL細(xì)胞合成和分泌,但是近來研究發(fā)現(xiàn),一些人和鼠CD4+T細(xì)胞也表達(dá)PFP。用HIV-1包膜蛋白抗原從CD4+T亞群中誘導(dǎo)出CD4+CTL,免疫組化結(jié)果顯示其胞漿顆粒中有PFP表達(dá),這些CD4+CTL約占T細(xì)胞總數(shù)的20%。那么這些CD4+CTL究竟是什么來源,筆者認(rèn)為可能有三種情況:(1)是CD4+CD8+(DP)T細(xì)胞,已經(jīng)有學(xué)者證實(shí)在免疫原的激發(fā)下,循環(huán)血或組織中的CD4+單陽T細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為DPT細(xì)胞,CD8+單陽T細(xì)胞也可轉(zhuǎn)化為DPT細(xì)胞,DPT細(xì)胞再通過穿孔素和顆粒酶破壞靶細(xì)胞或直接殺滅病原體而發(fā)揮免疫保護(hù)作用。有學(xué)者提出CD4+T細(xì)胞上CD8+抗原表達(dá)是CD4+T細(xì)胞活化的表現(xiàn)。(2)是自然殺傷T細(xì)胞(naturalkillerTcells,NKT):NKT是一類區(qū)別于自然殺傷細(xì)胞(NK)細(xì)胞、B細(xì)胞以及傳統(tǒng)的T細(xì)胞的另一種T細(xì)胞亞群,它既具有T細(xì)胞受體又有NK受體,根據(jù)CD4/8的表達(dá)看,可將其分為:①CD4+-NKT細(xì)胞;②CD8+-NKT細(xì)胞;③CD4-CD8-的DN-NKT細(xì)胞。NKT顯示T細(xì)胞和NK細(xì)胞雙重性質(zhì),可以通過TCR或細(xì)胞因子活化作用激活,產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子包括穿孔素和顆粒酶,殺傷靶細(xì)胞。NKT細(xì)胞與T細(xì)胞的不同之處在于T細(xì)胞分化為功能不同的Th1和Th2細(xì)胞群,而NKT能分泌Th1和Th2細(xì)胞因子,同時(shí)還具有與CD8+CTL細(xì)胞相同的殺傷靶細(xì)胞作用。(3)也可能來源于CD4+單陽T細(xì)胞。如果能設(shè)計(jì)一種