黑蘭州皮提取物體外抑菌效果研究

黑蘭州皮提取物體外抑菌效果研究

黑虎（lem.）a.c.smith，又名冷飯和南五味子，屬于木蘭科五味子科的多年生多年生喬木。分布于中國華南、華東、西南部等省。黑老虎為民間中草藥,藥用部位是根和藤莖,主要用于治療跌打骨折、風(fēng)濕骨痛、女性痛經(jīng)、慢性胃炎、急性胃腸炎等癥。黑老虎的垂直攀援性好,葉子四季碧綠,花形美麗,花香襲人,果形奇特,果肉香甜。黑老虎作為一種極具開發(fā)價值的集食用、觀賞、綠化及藥用于一體經(jīng)濟(jì)樹種,越來越受到人們的關(guān)注,已有一些地區(qū)開始人工栽培。前期研究發(fā)現(xiàn)黑老虎的根及藤莖中含有生物堿、酚類、木脂素、萜類及揮發(fā)油等藥用成分,具有抗腫瘤、抗氧化、抗-HIV、解毒等功效。黑老虎果實為聚合果,果肉營養(yǎng)價值較高,含有豐富的氨基酸和微量元素,但目前對其果皮的藥效成分的研究卻鮮有報道。本文對黑老虎果皮的抑菌活性進(jìn)行了初步研究,并確定了抑菌成分的極性部位,為黑老虎果藥用價值的進(jìn)一步研究開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。1材料表面1.1果皮、果皮和種子成熟的新鮮黑老虎果于2008-10采自廣西的桂西北地區(qū),存放于-20℃冰箱備用。實驗時將果實取出,于室溫解凍后用鑷子將果皮、果肉和種子分開,分別稱重。果皮于45℃烘箱中干燥,取部分果皮剪成直徑6.0mm的圓片用于抑菌實驗,其余果皮粉碎用于有效成分的提取。1.2乙醇浸提液的制備將干燥的果皮粉碎,秤取10g果皮粉,用50ml70%(V/V)的乙醇在室溫下浸提4h,過濾后的濾渣用等量的乙醇再提取1次。合并兩次濾液,在40℃下減壓濃縮至10ml,得到相當(dāng)于含生藥1g/ml的乙醇提取液用于隨后的實驗。1.3菌株和培養(yǎng)基本實驗所用的大腸埃希氏菌Escherichiacoli、金黃色葡萄球菌StaphyloccocusaureusRosenbach、銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa、傷寒沙門氏菌Salmonellatyphi、枯草桿菌Bacillussubtilis和白色念珠菌Moniliaalbicans由廣西中醫(yī)學(xué)院微生物與免疫教研室提供。白色念珠菌(屬真菌)用沙保氏液體養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)有限公司)于28℃培養(yǎng)72h,其余細(xì)菌用Mueller-Hinton(M-H)液體培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)有限公司)于37℃培養(yǎng)24h。吸取菌懸液用血球計數(shù)板計數(shù),用相應(yīng)的液體培養(yǎng)基將菌懸液調(diào)整到含菌濃度約106個/ml,立即用于制備含菌平板或最小抑菌濃度的測定。2方法2.1培養(yǎng)材料的制備用無菌鑷子夾取直徑為6.0mm的經(jīng)過濕熱滅菌(121℃,20min)的濾紙圓片,分別放入乙醇提取液或各相萃取液中浸泡10min。另取浸泡蒸餾水的濾紙片為陰性對照,浸泡200μg/ml的頭孢氨芐溶液的濾紙片為陽性對照。含藥濾紙片于45℃中烘干,冷藏于4℃?zhèn)溆?。分別取0.1ml不同菌懸液加到90mm的平板培養(yǎng)基上,用滅菌涂棒均勻地涂布在培養(yǎng)基表面,制成含菌平板。細(xì)菌用M-H瓊脂培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)有限公司),真菌用沙保氏瓊脂培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)有限公司)。取干燥的果皮圓片或含藥濾紙片貼在含菌平板上,每種菌做3塊重復(fù)平板。平板先在4℃中保存1h讓藥物滲入培養(yǎng)基,然后將細(xì)菌平板置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,真菌用28℃培養(yǎng)72h,取出平板觀察抑菌圈。2.2果皮的抑菌效果測定用試管將干燥的黑老虎果皮圓片分別置于40,60,80和100℃恒溫水浴鍋中保溫20min,另取一份果皮樣品于120℃的高壓滅菌鍋中處理20min,用濾紙片法觀察不同溫度處理的果皮對傷寒沙門氏菌的抑菌效果。2.3果皮提取物的制備采用二倍稀釋法測定黑老虎果皮乙醇提取物的最小抑菌濃度。取10支各裝有1mlM-H液體培養(yǎng)基的無菌試管進(jìn)行編號。其中,1～8號管配成含一定濃度梯度果皮提取物的培養(yǎng)基,1號管加入1ml乙醇提取物(含生藥1g/ml),充分混勻后取出1ml加入2號管,2號管充分混勻后又取出1ml加入3號管,依次類推到8號管,稀釋后1～8號管的果皮提取物含量分別為500,250,125,62.5,31.25,15.63,7.81,和3.91mg生藥/ml。9號管為不加藥物的陽性對照,1～9號管分別接種傷寒沙門氏菌懸液0.1ml,10號管為不接種的陰性對照,各處理均做3個平行管。所有試管置于37℃的恒溫箱中培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果,在9號陽性對照管出現(xiàn)混濁,而10號陰性對照管呈透明狀的前提下,觀察1～8號管的渾濁狀況,以不出現(xiàn)混濁的最低濃度為最小抑菌濃度。2.4最小殺菌濃度測定取上述培養(yǎng)好的各管菌懸液0.1ml,分別均勻涂布于M-H瓊脂平板培養(yǎng)基上,晾干后置于37℃的恒溫箱中培養(yǎng)24h,觀察菌落生長情況,以不長菌落的最低濃度為最小殺菌濃度。2.5乙醇提取與抑菌依次用等體積的石油醚、乙醚、正丁醇、醋酸乙酯和丙酮萃取上述所獲得的乙醇提取液,各相萃取液均在40℃下減壓濃縮至相當(dāng)于含生藥1g/ml的濃度,并用濾紙法進(jìn)行對傷寒沙門氏菌的抑菌試驗,檢測果皮的抑菌成分主要存在于哪一有機(jī)相中。3結(jié)果3.1果皮的抑制作用首先直接用干燥的黑老虎果皮圓片進(jìn)行抑菌實驗。在受試的6種菌中,果皮對傷寒沙門氏菌有明顯的抑制作用(圖1),而對其他5種菌無明顯的抑制效果。圖1中可見,果皮的抑菌圈小于陽性濾紙片(含頭孢氨芐),但果皮的抑菌圈很清晰而且重現(xiàn)性好。3.2抑菌圈的大小經(jīng)100℃和100℃以下溫度處理的果皮對傷寒沙門氏菌均有抑制作用,從抑菌圈的大小判斷,各處理的抑菌效果相當(dāng),經(jīng)120℃處理后的果皮則喪失抑菌能力。結(jié)果說明黑老虎果皮所含的抑菌成分在100℃以下不被破壞,具有較好的熱穩(wěn)定性。3.3果皮提取物抑制法不同濃度的果皮提取液對傷寒沙門氏菌的抑菌和殺菌效果見表1。1～5號試管的液體培養(yǎng)基保持透明狀態(tài),說明細(xì)菌的生長受到果皮提取物的抑制,最小抑菌濃度出現(xiàn)在5號試管,相當(dāng)于含生藥31.25mg/ml。當(dāng)這些培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到平板后,藥物濃度被稀釋,4,5號平板長出菌落,說明這個濃度只能抑制而不能殺死傷寒沙門氏菌。最小殺菌濃度出現(xiàn)在3號試管,相當(dāng)于含生藥125mg/ml。3.4蘋果樹葉片生長圖將黑老虎果皮的乙醇提取液和各段萃取液用于濾紙片抑菌試驗。結(jié)果如圖2?？梢郧宄目吹?只有乙醇提取液(圖2-1)和乙醚萃取相(圖2-3)有抑菌作用,黑老虎果皮抑菌成分主要存在于乙醚相中,經(jīng)乙醚萃取后的醇水相已經(jīng)沒有抑菌作用(圖2-4)。4皮對傷寒沙門氏菌的抑菌作用對黑老虎的藥效作用已有一些研究,如:劉錫鈞等從黑老虎根部分離得一種天然化合物晶I,藥理實驗證明有一定鎮(zhèn)靜和消炎作用;朱樹凡研究了中藥黑老虎對大鼠肝損傷的保護(hù)作用等。但關(guān)于黑老虎抑菌作用的研究卻很少,只有袁婷等研究了黑老虎根的抑菌作用,發(fā)現(xiàn)黑老虎根的水浸提液可以抑制肺炎球菌。本研究發(fā)現(xiàn)了黑老虎果皮對傷寒沙門氏菌的抑菌作用,兩項研究結(jié)果說明黑老虎的根和果皮中所含抑菌成分可能不是同一物質(zhì)。從本研究得知黑老虎果皮的抑菌成分極易溶于乙醚,其極性與乙醚相似,而且可以耐受100℃的高溫,具有較好的熱穩(wěn)定性,該成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)和其他理化性質(zhì)還有待于進(jìn)一步研究。傷寒沙門氏菌是腸桿菌科的致病菌,該菌通過食物進(jìn)入人體腸道,其內(nèi)毒素可引起胃腸炎、腸熱癥、傷寒和副傷寒等癥。近年來,傷寒沙門氏菌對抗生素的耐藥性呈上升態(tài)勢。本研究發(fā)現(xiàn),黑老虎果皮可以抑制傷寒沙門氏菌的生長,高濃度時可以殺死該菌,具有進(jìn)一步研究和開發(fā)的價值。另外,黑老虎果皮對傷寒沙門氏菌的抑菌作用與