細胞增殖及細胞活力檢測方法

細胞增殖及細胞活力檢測辦法現(xiàn)在重要有兩種用于檢測細胞增殖能力的辦法。一種是直接的辦法，通過直接測定進行分裂的細胞數(shù)來評價細胞的增殖能力。另一種是間接的辦法，即細胞活力（cellviability）檢測辦法，通過檢測樣品中健康細胞的數(shù)目來評價細胞的增殖能力。顯然，細胞活力檢測法并不能最后證明檢測樣品中的細胞與否在增殖。如細胞在某一培養(yǎng)條件下會自發(fā)啟動凋亡程序，但藥品的干擾可克制凋亡的發(fā)生；這時若采用細胞活力檢測法，顯然能夠分辨兩種條件下的細胞數(shù)量，但我們并不能從藥品干擾組細胞數(shù)不不大于對照組的事實闡明藥品可增進細胞增殖的結(jié)論。因此最直接的證據(jù)應(yīng)當采用辦法一。用于檢測細胞增殖能力最典型的辦法是用氚標記的胸腺嘧啶核苷解決細胞，再檢測DNA鏈中氚含量。若細胞含有增殖能力，DNA合成過程中將會采用氚標記的胸腺嘧啶核苷作為合成原料，因此檢測細胞DNA鏈內(nèi)標記核苷酸的量可判斷細胞與否進行DNA的合成。但更為慣用的辦法是BrdU檢測法。用BrdU預(yù)解決的細胞中，BrdU可替代胸腺嘧啶核苷插入復(fù)制的DNA雙鏈中，并且這種置換能夠穩(wěn)定存在，并帶到子代細胞中。細胞通過固定和變性解決后，可用免疫學(xué)辦法檢測DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU單克隆抗體特異識別BrdU,再采用辣根過氧化酶標記的山羊抗鼠IgG二抗標記，最后用比色法或熒光的辦法進行定量測定），從而判斷細胞的增殖能力。Calbiochem/EMD公司提供一種BrdU檢測試劑盒，以微孔板的形式，合并全部清洗、固定、變性的環(huán)節(jié)以單一試劑當中。比色檢測在一抗二抗標記后在450nm下讀數(shù)，全部操作在3小時內(nèi)結(jié)束。并且該試劑盒的敏捷度與市場上其它同類產(chǎn)品相比是最強的。1000個細胞以上水平的檢測只需用BrdU預(yù)孵育2小時，100個細胞則采用過夜預(yù)孵育，即可檢測細胞的增殖能力。BrdU法的一種缺點是需要固定和變性等破壞DNA的解決。有些狀況下，研究者可能但愿在測定細胞增殖能力的同時檢測細胞的總DNA含量，然而，在變性條件下，DNA的雙鏈構(gòu)造將被破壞，DAPI和Hoechest33342等核酸標記探針就不再能識別DNA，因而也無法預(yù)計DNA總量。MolecularProbes公司的Click-iTEdU檢測試劑盒能夠解決這個問題。這種辦法不需要變性環(huán)節(jié)，由于熒光探針標記的疊氮化物小分子，而不是龐大的抗體分子，能夠很容易的識別并結(jié)合未變性DNA雙鏈中的EdU分子。采用BrdU辦法時，你必須非常小心的去對DNA進行變性，才干首先使BrdU抗體進入細胞，另首先又保存足夠的雙鏈DNA分子來進行細胞周期的分析。有了EdU后則不同，由于你不再需要變性，這一切都很簡樸了；另外，常慣用于DNA變性的HCl，可能破細胞內(nèi)壞蛋白的抗原識別位點，因而限制了BrdU檢測法中同時檢測其它蛋白的應(yīng)用，但這種狀況在EdU法中不存在。圖1：EdU及BrdU原理示意圖（摘至invitrogen闡明書）在某些狀況下，細胞活力的檢測相稱于細胞增殖能力的測定。用于細胞活力檢測的辦法又諸多，這些辦法重要采用特殊的試劑來測定細胞的代謝活力，AlamarBlue，MTT及其它四唑鹽。它們通過檢測細胞的氧化還原活性來檢測細胞增殖能力，因此這是一種間接的辦法。Calbiochem的快速細胞增殖試劑盒，或者，嚴格來說，叫細胞活力試劑盒，采用一種四唑鹽試劑WST-1來對細胞活力進行快速的檢測。線粒體剪切WST－1試劑，產(chǎn)生一種水溶性的formazan鹽，因此這是一種相對可靠的測定健康細胞活力的辦法。一種類似的但更為敏捷的辦法是Calbiochem公司的超敏細胞增殖試劑盒，采用calcein-AM（一種熒光探針）來標記細胞。這種增加的敏捷度來自于額外的檢測環(huán)節(jié)，即采用PBS替代培養(yǎng)基或血清來減小背景。Invitrogen公司還提供了一種采用熒光素酶檢測細胞內(nèi)ATP水平的辦法。健康細胞中熒光素激發(fā)出的光能夠很容易讀出，并且含有非常小的背景。無熒光信號表明細胞線粒體不在產(chǎn)生ATP。因此，這些辦法固然也可用于細胞毒性檢測實驗。自由基（FreeRadical,FR）是含有孤電子的原子或原子團，活性氧（ReactiveOxygenSpecies,ROS）是指化學(xué)性質(zhì)活躍的含氧原子或原子團，涉及超氧陰離子自由基、過氧化氫（H2O2）、單線態(tài)氧、羥自由基（HO·）、烷過氧化自由基、脂過氧化自由基等。

FR和ROS在細胞內(nèi)可通過酶反映和非酶反映產(chǎn)生。其中線粒體是細胞內(nèi)FR和ROS產(chǎn)生的重要來源，約占細胞內(nèi)FR和ROS總量的98%左右[1]，由于線粒體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)濃度較高，大部分O2·-歧化為H2O2，后者可穿過線粒體膜進入胞漿。細胞內(nèi)膜系統(tǒng)如滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及過氧化物酶體里含有某些酶,如細胞色素p-450和b3家族、乙醇酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶、尿酸氧化酶等，這些酶對脂溶性藥品、不飽和脂肪酸、抗生素及其它代謝產(chǎn)物的氧化，亦可產(chǎn)生H2O2和O2·-等[2，3]。除此以外，某些可溶性氧化酶、吞噬細胞NADP氧化酶、磷脂酶A2(PLA2)等催化的反映，以及某些小分子的自氧化均是內(nèi)源性ROS產(chǎn)生的重要來源[1]，配體反映也可介導(dǎo)產(chǎn)生FR和ROS[4]。

衰老的自由基學(xué)說認為，隨著細胞復(fù)制衰老或生物整體衰老，F(xiàn)R和ROS在衰老的細胞和組織內(nèi)累積，損傷生物大分子如蛋白質(zhì)、脂類、核酸等，造成其構(gòu)造變化和功效喪失，甚至引發(fā)基因突變、DNA復(fù)制停止等，最后引發(fā)復(fù)制衰老和整體衰老，F(xiàn)R和ROS經(jīng)由哪些途徑引發(fā)衰老的呢？

1．FR和ROS可變化細胞的氧化還原狀態(tài)。細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)重要由谷胱甘肽(GSH)和硫氧還蛋白(TRX)兩對緩沖對進行調(diào)節(jié)，F(xiàn)R和ROS可氧化GSH和TRX，變化細胞內(nèi)相對穩(wěn)定的氧化還原狀態(tài)，進而影響信號傳導(dǎo)[5]。

2．FR和ROS通過氧化蛋白質(zhì)側(cè)鏈上核心的氨基酸殘基，如絲氨酸的羥基和半胱氨酸巰基，進而變化蛋白質(zhì)的構(gòu)造、影響蛋白質(zhì)多聚化、蛋白質(zhì)與Fe-S或其它金屬離子的結(jié)合等。如被氧化修飾的-OH或-SH位于酶的催化中心，則酶的催化活性喪失；如被氧化修飾的氨基酸殘基位于DNA結(jié)合域，則轉(zhuǎn)錄因子失去了與DNA結(jié)合及調(diào)控轉(zhuǎn)錄的能力；而蛋白質(zhì)若不能與Fe-S結(jié)合，則呼吸鏈電子傳遞及氧化磷酸化受阻。另外，損傷的蛋白質(zhì)半壽期延長，而衰老的細胞中蛋白質(zhì)合成速率下降，造成受損傷的蛋白質(zhì)更新率下降[6]。

3．FR和ROS可氧化DNA，使其斷裂或突變，DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄受阻[7，8]。如果FR和ROS造成的DNA單鏈斷裂發(fā)生于染色體端區(qū)末端，則端區(qū)縮短加緊。在正常培養(yǎng)條件下，人二倍體成纖維細胞的端區(qū)縮短速率重要取決于細胞內(nèi)的氧化壓力[9]。

4．FR和ROS加速了細胞內(nèi)非酶糖基化反映，以及大分子如蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)[10]。

5．FR和ROS損傷端區(qū)，可能引發(fā)了衰老有關(guān)基因如p16和p21的過體現(xiàn)。MTT法測定細胞相對數(shù)和相對活力

一、原理

噻唑蘭，簡稱MTT，可透過細胞膜進入細胞內(nèi)，活細胞線粒體中的琥珀脫氫酶能使外源性MTT還原為難溶于水的藍紫色的Formazan結(jié)晶并沉積在細胞中，結(jié)晶物能被二甲基亞砜（DMSO）溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波優(yōu)點測定其光吸取值，可間接反映細胞數(shù)量。

細胞活性測定辦法有臺盼藍染色法、克?。洌┬纬煞?、3H放射性同位素摻入法、MTT法等。其中MTT法以其快速簡便，不需要特殊檢測儀器、無放射性同位素、適合大批量檢測的特點而得到廣泛的應(yīng)用。但MTT法形成的Formazan為水不溶性的，需要加有機溶劑溶解，由于在去上清操作時會有可能帶走小部分的Formazan，故有時重復(fù)性略差。為理解決這個問題，研究人員又開發(fā)了諸多個水溶性的四氮唑鹽類：如XTT、CCK-8（WST-8）等。

現(xiàn)就這三種四氮唑鹽類辦法作一種簡樸介紹：

1.MTT法

MTT：化學(xué)名：3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功效。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波優(yōu)點測定其光吸取值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范疇內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比。該辦法已廣泛用于某些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥品篩選、細胞毒性實驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是敏捷度高、經(jīng)濟。

缺點：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才干檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗成果的精確性產(chǎn)生影響，并且溶解甲的有機溶劑對實驗者也有損害。2.XTT法

XTT：化學(xué)名：2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]

-2H-tetrazoliumhydroxide，作為線粒體脫氫酶的作用底物，被活細胞還原成水溶性的橙黃色甲產(chǎn)物。當XTT與電子偶合劑（例如PMS）聯(lián)合應(yīng)用時，其所產(chǎn)生的水溶性的甲產(chǎn)物的吸光度與活細胞的數(shù)量成正比。

優(yōu)點：1、使用方便，省去了洗滌細胞；2、檢測快速；3、敏捷度高，甚至能夠測定較低細胞密度；4、重復(fù)性優(yōu)于MTT。

缺點：XTT水溶液不穩(wěn)定，需要低溫保存或現(xiàn)配現(xiàn)用。3.CCK-8法或稱WST-8法

CCK-8試劑中含有WST–8：化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽]，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細胞線粒體中的脫氫酶還原為含有高度水溶性的黃色甲產(chǎn)物（Formazan）。生成的甲物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比。用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波優(yōu)點測定其光吸取值，可間接反映活細胞數(shù)量。該辦法已被廣泛用于某些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥品篩選、細胞增殖實驗、細胞毒性實驗以及藥敏實驗等。

優(yōu)點：1、使用方便，省去了洗滌細胞，不需要放射性同位素和有機溶劑；2、檢測快速；3、敏捷度高，甚至能夠測定較低細胞密度；4、重復(fù)性優(yōu)于MTT；5、對細胞毒性??；6、為1瓶溶液，毋需預(yù)制，即開即用。

缺點:1、與MTT相比，CCK-8和XTT的價格比較貴。2、CCK-8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養(yǎng)基顏色靠近，不注意的話容易產(chǎn)生漏加或多加。

三種辦法的比較

MTT法XTT法CCK-8法（WST-8法）甲物水溶性難溶性水溶性水溶性檢測波長490nm450nm450nm性狀粉末2瓶溶液1瓶溶液使用辦法配成溶液后使用現(xiàn)配現(xiàn)用毋需預(yù)制使用有機溶劑DMSO或其它溶劑——方便性++++++檢測速度++++++重復(fù)性+++++穩(wěn)定性+++++工作量------對細胞毒性------對人體毒性-----

一、介紹流式細胞儀（一）流式細胞儀概念流式細胞術(shù)（FlowCytometry，F(xiàn)CM）是一種對處在液流中的細胞或其它生物微粒（如細菌）逐個進行多參數(shù)的快速定量分析和分選的技術(shù)。簡言之，流式細胞儀是測量染色細胞標記物熒光強度的細胞分析儀，是在單個細胞分析和分選基礎(chǔ)上發(fā)展起來的對細胞的物理或化學(xué)性質(zhì)，如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等進行快速測量并可分類收集的高技術(shù)，F(xiàn)CM以其快速、靈活、大量、敏捷和定量的特色，廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床實踐各個方面，涉及細胞生物學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)、免疫學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)及臨床檢查學(xué)等，在各學(xué)科領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用。（二）原理待測樣本的細胞懸液，在鞘液的包圍和約束下，細胞排成單列高速由流動室噴嘴噴出，形成細胞液柱。當液柱通過檢測區(qū)，在入射的激光束照射下產(chǎn)生前向散射光（FSC）和側(cè)向散射光（SSC），它們分別反映細胞大小和顆粒度，根據(jù)這些特性能夠?qū)⒓毎诸悺＝?jīng)一種或幾個特殊熒光標記的樣本，在激光束的激發(fā)下所產(chǎn)生的特定熒光，可被光學(xué)系統(tǒng)檢測并輸送到計算機進行分析，得到細胞對應(yīng)的多個特性。（三）流式細胞儀檢測的細胞特性細胞構(gòu)造構(gòu)成細胞功效大小細胞表面、胞漿、核特異性抗原粒度細胞活性DNA、RNA含量胞內(nèi)細胞因子蛋白質(zhì)含量激素結(jié)合位點鈣離子、pH值、膜電位酶活性人體抑癌基因。該基因編碼一種分子量為53kDa的蛋白質(zhì)，命名為P53。p53基因的失活對腫瘤形成起重要作用。但是事物必然有它的兩個方面，p53是一種重要的抗癌基因使癌細胞自殺，避免癌變；還含有協(xié)助細胞基因修復(fù)缺點的功效。這種功效對于受化療藥品作用而受傷的癌細胞，則起修復(fù)作用，而不是使癌細胞自殺。造成被修復(fù)的癌細胞在治療后成為新的腫瘤。領(lǐng)導(dǎo)這一研究的是麻省大學(xué)醫(yī)學(xué)院JoelD.Richter專家，這位科學(xué)家對于發(fā)育與疾病過程中的調(diào)控機制十分感愛好，至今已發(fā)表有關(guān)研究成果多項，特別是有絲分裂，減數(shù)分裂過程中的機制。

mRNA的3’端被一段“非模板”的腺嘌呤（即polyA尾端）所覆蓋，其作用是增強它們的翻譯。polyA聚合酶Gld2被序列特異性CPEB蛋白引導(dǎo)到3’端未翻譯的區(qū)域。在這篇文章中，研究人員發(fā)現(xiàn)p53腫瘤克制因子不只是簡樸地被Gld2多聚腺苷?；?。而是Gld2能夠?qū)⒁环NA添加到miR-122小RNA上，從而使其穩(wěn)定。這種腺苷?；膍iR-122/RISC復(fù)合物然后通過在其3’端未翻譯區(qū)域結(jié)合目的點來克制CPEB的體現(xiàn)。如果CPEB不被miR-122克制，那么CPEB將與p53的3’端未翻譯區(qū)域結(jié)合，并結(jié)合一種不同的polyA聚合酶，即Gld4。這些數(shù)據(jù)反映了p53mRNA的翻譯控制的一種以前人們不懂得的層級關(guān)系，這一層級關(guān)系造成細胞衰老。這種小RNA：miR-122含有許多重要的作用，之前的研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織miR-122的體現(xiàn)與肝癌細胞周期調(diào)控親密有關(guān)，近來的研究又顯示，miR-122能夠通過影響p53蛋白的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性，調(diào)節(jié)細胞周期蛋白CyclinG的體現(xiàn)，從而減少癌細胞的侵襲性。這些都闡明了這種小分子與p53的關(guān)系親密。這對于進一步理解p53的作用品有重要的意義。除此之外，有關(guān)p53，近期布魯塞爾自由大學(xué)的研究人員也獲得了新進展，他們證明一種重要的腫瘤克制因子p53的某些突變可造成蛋白質(zhì)發(fā)生錯誤折疊從而在細胞內(nèi)積聚。這不僅破壞了正常p53的保護功效，同樣還可累積其它有關(guān)蛋白，從而造成癌癥的發(fā)生。過去的研究表明大概有二分之一的癌癥中都存在p53基因突變，從而科學(xué)家們將其視為開發(fā)新型癌癥治療的重要靶點。而這項研究揭示了突變p53在癌癥中一種新的作用機制：p53突變使得p53蛋白喪失了它的保護性功效，并造成這些蛋白質(zhì)變化形狀，互相之間發(fā)生聚合，開始在細胞內(nèi)積聚。研究成果表明大概1/3的p53突變細胞存在這樣的作用機制。研究人員還發(fā)現(xiàn)突變可能造成p53獲得了完全不同的特性，進而從抑癌因子轉(zhuǎn)變成為了加速腫瘤生長的物質(zhì)。在進一步的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)突變p53似乎還與細胞內(nèi)的調(diào)控分子p63和p73形成了積聚物，從而造成這些調(diào)控分子喪失了本身的功效。美國Brown大學(xué)最新研究發(fā)現(xiàn)，即使在果蠅神經(jīng)細胞中的瘤克制蛋白p53的活性減少的狀況下，果蠅仍然能健康存活很長時間。論文發(fā)表在最新一期的國際生物學(xué)期刊《CurrentBiology》中，研究成果為p53的功效研究提供了重要的信息，"基因組的守護神"——p53對抗衰老藥品的研究也含有一定的參考價值。P53基因在體內(nèi)含有重要的地位。它通過產(chǎn)生一種能引發(fā)細胞調(diào)亡的蛋白質(zhì)來保護人類細胞，或是在DNA受到嚴重損傷時促使細胞自殺，這樣便能夠制止遺傳突變的擴展和癌癥的形成。當p53受損或缺失時，就會造成癌癥。事實上，有53％的癌癥患者攜帶有p53突變體。然而，當人類的守護基因p53極度活躍，瘤克制蛋白比正常水平更高的時候，老鼠的衰老進程就會加速并且壽命縮短。生物學(xué)家StephenHelfand等的研究顯示，p53基因中存在一種“臨界點”。如果p53蛋白的含量低于這個"臨界點"，特別是神經(jīng)細胞中的p53，便能延長果蠅的健康生存時間。因此，p53活性的減少對衰老會產(chǎn)生重大的影響。美國康涅狄格大學(xué)的研究人員發(fā)現(xiàn)對p53蛋白進行修飾能夠延長壽命，Brown大學(xué)的Helfand專家等用果蠅進行了檢測實驗。由于果蠅中有數(shù)千個基因與人類相似，并且它也體現(xiàn)p53基因。實驗中用的果蠅攜帶有p53的突變體，當突變基因體現(xiàn)后，會產(chǎn)生一種突變體進而形成新的p53蛋白，該蛋白會使正常的p53蛋白失活，但是這種影響只發(fā)生在神經(jīng)細胞中。為什么挑選神經(jīng)細胞來做實驗?zāi)?？由于成熟的神?jīng)細胞不會分裂，這樣發(fā)展為癌癥的幾率就比較小。研究成果顯示，攜帶成熟突變體的果蠅中58％都會長壽，平均壽命為60天，而正常狀況下果蠅的平均壽命為38天。與此同時，果蠅還會健康生長，還會繼續(xù)取食、運動以及繁殖后裔。但是，現(xiàn)在的實驗還不能解釋為什么p53活性的減少能延長壽命。有現(xiàn)象暗示這是卡路里限制的因素，這一生化機理能夠延緩衰老。為了檢查這個構(gòu)想，研究人員不進行卡路里限制，喂養(yǎng)了某些果蠅，發(fā)現(xiàn)果蠅不再長壽，這表明了該途徑是存在的。p53和pRB蛋白是兩種核心的腫瘤克制因子，在誘導(dǎo)衰老方面有著決定性的作用，普通我們說的兩條衰老信號通路是指pRB信號通路和p53信號通路。人類的細胞衰老通路體現(xiàn)為兩條平行的（與小鼠的一條形成對比）通路，這樣將使得細胞不容易繞過衰老過程，從而克制了腫瘤的發(fā)生。但是這種構(gòu)想受到了近年來的某些實驗的挑戰(zhàn)，如人的肺成纖維細胞，通過體細胞同源重組技術(shù)，使得p53或PRB失活，能夠避開衰老過程，這就有些像小鼠身上的單線狀的衰老通路(Weietal.,)；并且，與小鼠形成對照的是，通過同源重組造成的p21的失活足以避開衰老過程，表明了p21作為p53和PRB兩通路的聯(lián)系者的身份(Brownetal.,1997a)。有關(guān)p53和PRB蛋白的作用，現(xiàn)在有一種比較承認的見解是：p53通路介導(dǎo)的是端粒功效異常、DNA損傷引發(fā)的衰老過程；p16/pRB通路介導(dǎo)的是致癌基因的體現(xiàn)、染色質(zhì)斷裂、多個多樣的脅迫等等引發(fā)的衰老過程(WrightandShay,;CollinsandSedivy,;BenPorathandWeinberg,)。但是現(xiàn)在這兩條通路的標志性分子尚未找到，并且在不同種、組織的細胞中兩條通路的重要性又有所不同，因此對于衰老通路的理解正處在不停深化的過程中。下面簡樸看一下兩個通路狀況：(一)p53通路p53蛋白能夠激活下游分子，如p21CIP1/WAF1(KuljuandLehman,1995)，或是其它的蛋白分子來激活pRB實現(xiàn)衰老過程（小鼠）；并且，在人身上，能夠不依賴PRB激活衰老。p53的失活會造成某些復(fù)制型衰老的細胞徹底地逆轉(zhuǎn)衰老過程(GireandWynford-Thomas,1998)。類似地，p21（p53的轉(zhuǎn)錄激活的靶子，是一種細胞周期循環(huán)的克制分子）的失活，會使得細胞繞過端粒依賴的復(fù)制型衰老，進入一種危機狀態(tài)(Brownetal.,1997b)。p53的激活是通過磷酸化（ATM/ATR，Chk1/Chk2蛋白分子的功績），p19(ARF)(克制Mdm2)的激活來實現(xiàn)。p53在細胞對DNA損傷反映（涉及衰老反映）過程中是一種核心性的調(diào)節(jié)因子(WahlandCarr,)。在人的細胞中，p53的缺失會延遲或是阻斷復(fù)制型衰老(Itahanaetal.,)。致癌基因RAS的體現(xiàn)通過ROS來實現(xiàn)，而ROS是在促有絲分裂以及促細胞衰老的過程中是必需的。RAS的過量體現(xiàn)，可能會通過p53依賴的損傷反映（即產(chǎn)生大量的DNA損傷的ROS）來造成衰老反映；同時RAS也會誘導(dǎo)p16的體現(xiàn)，p16是pRB的激活劑(Ferbeyreetal.,;Pearsonetal.,;Serranoetal.,1997)。兩個蛋白都能妨礙潛在的腫瘤細胞的增殖?？傊?，在某些細胞中，DNA損傷引發(fā)的衰老感應(yīng)，端粒異常，以及某些致癌性基因的體現(xiàn)會通過p53通路來造成細胞衰老，p53通路在當中起的作用不僅是必要并且還是充足條件。（二）pRB通路p53對于某些細胞逆轉(zhuǎn)衰老克制非常有效，但也不居然(Beausejouretal.,c;Herbigetal.,b;Sakamotoetal.,1993)。有些細胞在p53敲除后，還能呈現(xiàn)衰老狀態(tài)。這種細胞往往或多或少地體現(xiàn)細胞周期的克制因子p16。小鼠體內(nèi)的研究表明p16妨礙了自發(fā)性的惡性腫瘤的發(fā)生(Sharplessetal.,)。細胞培養(yǎng)的研究表明，p16制止了由p53失活引發(fā)的逆轉(zhuǎn)衰老的現(xiàn)象；并且對RAS引導(dǎo)的衰老過程是必需的(Beausejouretal.,b;BenantiandGalloway,a;Brookesetal.,)。p16的體現(xiàn)通過脅迫