不同提取方法對溪黃草抗氧化性的影響

不同提取方法對溪黃草抗氧化性的影響

屬唇科香茶植物，是一種多年生草本植物。據(jù)中華大辭典記載,溪黃草具有清熱祛濕、涼血散瘀之功效,對急性肝炎、腸炎、痢疾等有較好效果。溪黃草含萜類、黃酮類、酚類、氨基酸等多種化學成分。酚類化合物具有較強的抗氧化性,研究表明其抗氧化性能減緩冠狀動脈硬化、癌癥和年齡相關(guān)的大腦退行性疾病,另還具有抗菌、抗炎和舒張血管的作用。鑒于多種慢性病及退行性疾病與體內(nèi)的氧自由基過剩有關(guān),因此從溪黃草中提取酚類化合物,并評價其抗氧化性強弱就顯得非常有必要。常壓回流提取法能高效快速從天然產(chǎn)物中提取有效成分,因此天然產(chǎn)物有效成分提取普遍采用常壓回流提取法?；亓魈崛》ǔ２捎盟?、乙醇或水-乙醇作為提取劑,而水、乙醇的沸點又較高,高溫對于天然產(chǎn)物中熱敏性物質(zhì)是一種威脅。減壓回流提取法通過改變體系真空度有效降低提取溶劑的沸點,熱敏性物質(zhì)不會被高溫破壞,且提取過程在真空條件下進行,提取物不會被氧氣所氧化。另外,真空條件下,溶劑能在低溫下保持沸騰和回流,有利于物料與溶劑的混合及有效成分的溶出。本文對比了常壓回流提取法與減壓提取法得到的溪黃草不同溶劑提取物總酚,黃酮,單寧提取率,并用DPPH·清除能力及鐵氰化鉀還原力作指標評價了抗氧化性強弱。1材料和方法1.1yl-1-picryl及其他溪黃草,購于廣州萬怡藥房五山店,廣東產(chǎn)。DPPH·(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl):Sigma公司;磷酸二氫鈉,磷酸氫二鈉,無水乙醇,丁醇,乙酸乙酯,鐵氰化鉀,三氯乙酸,氯化鐵,無水碳酸鈉,鎢酸鈉,鉬酸鈉,磷酸,濃鹽酸,硫酸鋰,溴水,沒食子酸,蘆丁,均為分析純。1.2方法1.2.1樣品溶液的制備1.2.1.提取貯備液制備水提取物:稱取5.0g溪黃草(粉碎過80目篩),按料液比1:20(g:mL)添加100mL水,調(diào)節(jié)真空度0.095MPa,55℃減壓回流2h,55℃濃縮至干,用60%乙醇定容至50mL,制成水提取物貯備液;乙酸乙酯提取物:稱取5.0g溪黃草(粉碎過80目篩),按料液比1:20(g:mL)添加100mL乙酸乙酯,調(diào)節(jié)真空度0.095MPa,30℃減壓提取(微沸狀態(tài))2h,35~40℃濃縮至干,用60%乙醇定容至50mL,制成乙酸乙酯提取物貯備液;60%乙醇提取物:稱取5.0g溪黃草(粉碎過80目篩),按料液比1:20(g:mL)添加100mL60%乙醇,調(diào)節(jié)真空度0.095MPa,33℃減壓回流2h,40~45℃濃縮至干,用60%乙醇定容至50mL,制成60%乙醇提取物貯備液;丁醇提取物:稱取5.0g溪黃草(粉碎過80目篩),按料液比1:20(g:mL)添加100mL丁醇,調(diào)節(jié)真空度0.095MPa,66℃減壓回流2h,65~75℃濃縮至干,用60%乙醇定容至50mL,制成丁醇提取物貯備液。1.2.1.乙酸乙酯提取物貯備液的制備水提取物:稱取5.0g溪黃草(粉碎過80目篩),按料液比1:20(g:mL)添加100mL水,100℃回流2h,55℃濃縮至干,用60%乙醇定容至50mL,制成水提取物貯備液;乙酸乙酯提取物:稱取5.0g溪黃草(粉碎過80目篩),按料液比1:20(g:mL)添加100mL乙酸乙酯,80℃回流2h,35~40℃濃縮至干,用60%乙醇定容至50mL,制成乙酸乙酯提取物貯備液;60%乙醇提取物:稱取5.0g溪黃草(粉碎過80目篩),按料液比1:20(g:mL)添加100mL60%乙醇,80℃回流2h,40~45℃濃縮至干,用60%乙醇定容至50mL,60%乙醇提取物貯備液;丁醇提取物:稱取5.0g溪黃草(粉碎過80目篩),按料液比1:20(g:mL)添加100mL丁醇,114℃回流2h,65~75℃濃縮至干,用60%乙醇定容至50mL,制成丁醇提取物貯備液。1.2.2抗氧化性評價1.2.2.dpph清除率測定參考WeiLuo等人的方法,并作適當修改。吸取樣品待測液將不同提取方法不同溶劑制備的提取物貯備液做適當稀釋,每個樣品至少做5個稀釋度,便于計算各提取物貯備液EC50值)2.0mL,加入0.2mmol/LDPPH·溶液2.0mL,搖勻,放置30min。以無水乙醇調(diào)零,測定517nm處的吸光度A樣品。測定樣品待測液2.0mL與無水乙醇2.0mL混合液在517nm處的吸光度A對照,再測定2.0mLDPPH·溶液與2.0mL無水乙醇在517nm處的吸光度A空白。DPPH清除率按以下公式計算。EC50值為自由基清除率達到50%時的樣品濃度。1.2.2.含量測定參考DinaAtmani等人的方法,并作適當修改。取1mL樣品待測液(將不同提取方法不同溶劑制備的提取物貯備液做適當稀釋,每個樣品至少做5個稀釋度,便于計算各提取物貯備液EC50值),加入pH6.6的磷酸緩沖液2.5mL和1%(質(zhì)量百分數(shù))鐵氰化鉀溶液2.5mL,混合后在50℃放置20min,加入10%(質(zhì)量百分數(shù))三氯乙酸溶液2.5mL,4800r/min離心10min,取上清液2.5mL,加入2.5mL蒸餾水和0.1%(質(zhì)量百分數(shù))氯化鐵2.5mL,混勻,靜置10min,在700nm處測定吸光度。還原力的EC50值為還原力達到0.5時的樣品濃度。1.2.3單酚、黃酮和單提取率的測定1.2.3.總酚含量的測定標準曲線的繪制:參考H.J.D.Dorman等人的方法,并作適當修改。稱取120℃干燥恒重沒食子酸9.4mg,蒸餾水定容至100mL。分別精密量取沒食子酸溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mL置10mL容量瓶中,加水至約6mL,搖勻,各加Folin-Ciocalteu試劑0.5mL,搖勻,在1~8min內(nèi)加20%(質(zhì)量百分數(shù))碳酸鈉溶液1.5mL,用蒸餾水稀釋至刻度,搖勻,在40℃水浴上保溫2h,迅速冷卻,立即在760nm處測定吸光度。提取物總酚提取率測定:按照標準曲線繪制方法測定?？偡犹崛÷室悦?00g原料中提取出的總酚含量表示。實驗均重復3次。1.2.3.吸光度標準曲線的繪制:參考RobertSocha等人的方法,并作適當修改。稱取120℃干燥恒重蘆丁5.1mg,用60%微熱乙醇定容至50mL,準確吸取標準應(yīng)用液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于6只10mL容量瓶中,加30%乙醇使成5mL,加5%NaNO2溶液0.3mL,搖勻,放置6min,加10%Al(NO3)3溶液0.3mL,搖勻,放置6min,加1mol/LNaOH溶液4mL,加水0.4mL,搖勻,放置15min,于510nm波長處測定吸光度。提取物黃酮提取率測定:按照標準曲線繪制方法測定。黃酮提取率以每100g原料中提取出的黃酮含量表示。實驗均重復3次。1.2.3.提取整理的過程采用張婷等人的方法,并作適當修改。用干酪素振搖吸附單寧后,用Folin-Ciocalteu法測定單寧含量。分別吸取0.1mL待測樣品加水定容至10mL后傾入100mL三角瓶中,加入精密稱取的100mg干酪素,混勻,放入搖床中振搖后(150r/min,45min),取出過濾,得濾液。測定濾液中未被吸附的總酚含量,用總酚含量減去干酪素吸附單寧后測得總酚含量可得單寧含量。提取物單寧提取率計算:提取率以每100g原料中提取出的單寧含量表示。實驗均重復3次。2結(jié)果與討論2.1抗氧化性的比較2.1.1dpph分辨率2.1.1.dpph清除活性測定由表1可看出,EC50值按從小到大排列順序是:60%乙醇提取物<丁醇提取物<乙酸乙酯提取物<水提物,說明DPPH·清除能力:60%乙醇提取物>丁醇提取物>乙酸乙酯提取物>水提物。2.1.1.dpph清除活性測定由表1可看出,EC50值按從小到大排列順序是:60%乙醇提取物≈丁醇提取物<乙酸乙酯提取物<水提物,說明DPPH·清除能力:60%乙醇提取物≈丁醇提取物>乙酸乙酯提取物>水提物。2.1.1.dpph清除能力測定由表1可看出,兩種提取法不同溶劑提取物DPPH·清除能力受提取溶劑極性影響。兩種提取法均表明:溪黃草提取物中,DPPH·清除能力:60%乙醇提取物>(≈)丁醇提取物>乙酸乙酯提取物>水提物。另外,相同溶劑做提取劑條件下:常壓回流提取物的EC50均小于減壓回流提取物,說明相同溶劑做提取劑條件下,常壓回流提取物的DPPH·清除能力強于減壓回流提取物。2.1.2鐵氰化鉀的恢復能力2.1.2.還原能力測定由表2可看出,EC50值按從小到大排列順序是:60%乙醇提取物<丁醇提取物<乙酸乙酯提取物<水提物,說明鐵氰化鉀還原能力:60%乙醇提取物>丁醇提取物>乙酸乙酯提取物>水提物。2.1.2.還原能力的測定由表2可看出,EC50值按從小到大排列順序是:60%乙醇提取物≈丁醇提取物<乙酸乙酯提取物≈水提物,說明鐵氰化鉀還原能力:60%乙醇提取物≈丁醇提取物>乙酸乙酯提取物≈水提物。2.1.2.不同溶劑提取的溪黃草提取物抗氧化活性指標由表2可看出,兩種提取法不同溶劑提取物鐵氰化鉀還原能力受提取溶劑極性影響。兩種提取法均表明:溪黃草提取物中,鐵氰化鉀還原能力:60%乙醇提取物>(≈)丁醇提取物>乙酸乙酯提取物>(≈)水提物。另外,相同溶劑做提取劑條件下:常壓回流提取物的EC50均小于減壓回流提取物,說明相同溶劑做提取劑條件下,常壓回流提取物的鐵氰化鉀還原能力強于減壓回流提取物。綜上所述,以DPPH·清除能力,鐵氰化鉀還原能力作抗氧化指標,實驗結(jié)果均表明:以60%乙醇作提取劑,溪黃草提取物的抗氧化性最高,其次是丁醇,然后是乙酸乙酯,最后是水。在相同溶劑提取條件下,常壓回流提取物的抗氧化性高于減壓回流提取物。2.2單酚、黃酮和單提取率的測定2.2.1黃酮提取率計算由圖1可知,總酚提取率按高低排列:60%乙醇提取物>丁醇提取物>乙酸乙酯提取物>水提物。黃酮提取率按高低排列:60%乙醇提取物>丁醇提取物>乙酸乙酯提取物>水提物。單寧提取率按高低排列:60%乙醇提取物≈丁醇提取物>乙酸乙酯提取物>水提物。2.2.2提取方法的比較由圖2可知,總酚提取率按高低排列:60%乙醇提取物>丁醇提取物>乙酸乙酯提取物>水提物。黃酮提取率按高低排列:60%乙醇提取物>丁醇提取物>乙酸乙酯提取物≈水提物。單寧提取率按高低排列:60%乙醇提取物>丁醇提取物>乙酸乙酯提取物>水提物。綜上所述,不同溶劑作提取劑,對溪黃草總酚、黃酮、單寧的提取率存在影響?？偟恼f來,用60%乙醇作提取劑,溪黃草總酚、黃酮、單寧的提取率是最高的,其次是丁醇,然后是乙酸乙酯,最后是水。用60%乙醇作提取劑時,減壓回流法總酚提取率高于常壓回流提取法總酚提取率,兩種提取方法對黃酮、單寧提取率影響不大;用丁醇作提取劑時,減壓回流提取法總酚、單寧提取率高于常壓回流提取法總酚、單寧提取率,但減壓回流提取法黃酮提取率稍低于常壓回流提取法黃酮提取率;對于以乙酸乙酯、水作提取劑,常壓回流提取法總酚、黃酮、單寧的提取率均高于減壓回流提取法總酚、黃酮、單寧的提取率。2.3提取方法的比較實驗結(jié)果表明:溪黃草提取物抗氧化性及總酚、黃酮、單寧提取率均受提取溶劑極性影響。另外,在相同溶劑提取條件下,溪黃草提取物抗氧化性及總酚、黃酮、單寧提取率均受不同提取方法影響。常壓回流提取物的抗氧化性高于減壓回流提取物的抗氧化性。對于總酚、黃酮、單寧提取率,在以60%乙醇或丁醇作提取劑時,減壓回流提取法優(yōu)于常壓回流提取法;在以乙酸乙酯或水作提取劑時,常壓回流提取法優(yōu)于減壓回流提取法。因此,溪黃草總酚、黃酮、單寧提取率高低不一定與抗氧化性強弱有直接相關(guān)性,特別是選擇不同體外抗氧化評價指標時。雖然,鑒于總酚、黃酮、單寧具有良好抗氧化性,也不排除溪黃草中其他化合物對抗氧化性所作的貢獻。即是說:溪黃草中除總酚、黃酮、單寧外,還有其他物質(zhì)會對抗氧化性有貢獻。若將抗氧化性作為兩種提取方法提取效率的評判指標,則常壓回流提取法優(yōu)于減壓回流提取法。減壓回流提取物抗氧化性弱于常壓回流提取物的原因可能在于:為了追求在盡可能低的溫度下保證提取溶劑的沸騰,回流狀態(tài),采取了較高的真空度,提取溶劑可能來不及被冷凝,回流,就被真空泵抽走,導致料液比下降,影響有效成分溶出。雖然常壓回流提取法溫度高于減壓回流提取法,但溶劑能有效回流,保持恒定的料液比,更有利于有效成分的溶出。料液