分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用儀器及使用方法

1、實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)目 錄實(shí)驗(yàn)一 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用儀器及使用方法實(shí)驗(yàn)二 質(zhì)粒 DNA 的提取-堿裂解法實(shí)驗(yàn)三 瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)四 限制性內(nèi)切核酸酶的酶切與鑒定實(shí)驗(yàn)五 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)六 動(dòng)物組織細(xì)胞基因組 DNA 提取實(shí)驗(yàn)七 DNA 的定量實(shí)驗(yàn)八 PCR 基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)九 瓊脂糖凝膠電泳分離與純化目的 DNA實(shí)驗(yàn)十 DNA 重組實(shí)驗(yàn)十一 動(dòng)物組織細(xì)胞總 RNA 的提取實(shí)驗(yàn)一 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用儀器及使用事實(shí)證明, 在科學(xué)飛速發(fā)展的今天, 無(wú)論從事哪個(gè)領(lǐng)域的研究,要想突破,除了有良好的理論基礎(chǔ)外,更重要的是依賴于先進(jìn)的技術(shù)和優(yōu)良的儀器設(shè)備以及良好的研究環(huán)境。 一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

2、室除了具有一般生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)儀器設(shè)備外, 還具有一些特 殊用途的儀器, 這些儀器一般較精密, 價(jià)格昂貴。 下面介紹這些儀器的使用方法和注意事項(xiàng)。一、冷凍離心機(jī)低溫分離技術(shù) 是分子生物學(xué)研究中必不可少的手段。 基因片段的分離、酶蛋白 的沉淀和回收以及其它生物樣品的分離制備實(shí)驗(yàn)中都離不開(kāi)低溫離心技術(shù) , 因此低溫冷凍離 心機(jī)成為分子生物學(xué)研究中必備的重要儀器。 在國(guó)內(nèi), 有多個(gè)廠家生產(chǎn)冷凍離心機(jī), 本實(shí)驗(yàn) 室的高速冷凍離心機(jī)為 GL-20G-型(上海安亭 ,落地式。配有角式轉(zhuǎn)頭:6×50ml 、 12×10ml 和 12×1.5ml 。極限轉(zhuǎn)速 20000rpm

3、。1. 安裝與調(diào)試離心機(jī)應(yīng)放置在水平堅(jiān)固的地面上,應(yīng)至少距離 10cm 以上且具有良好的通風(fēng)環(huán)境 中,周?chē)諝鈶?yīng)呈中性,且無(wú)導(dǎo)電性灰塵、易燃?xì)怏w和腐蝕性氣體,環(huán)境溫度應(yīng)在 030 之間,相對(duì)濕度小于 80%。試轉(zhuǎn)前應(yīng)先打開(kāi)蓋門(mén),用手盤(pán)動(dòng)轉(zhuǎn)軸,輕巧靈活,無(wú)異?，F(xiàn)象 方可上所用的轉(zhuǎn)頭。 轉(zhuǎn)子準(zhǔn)確到位后打開(kāi)電源開(kāi)關(guān),然后用手按住門(mén)開(kāi)關(guān), 再按運(yùn)轉(zhuǎn)鍵,轉(zhuǎn) 動(dòng)后立即停止,并觀察轉(zhuǎn)軸的轉(zhuǎn)向,若逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)即為正確,機(jī)器可投入使用。2. 操作程序(1插上電源, 待機(jī)指示燈亮; 打開(kāi)電源開(kāi)關(guān),調(diào)速與定時(shí)系統(tǒng)的數(shù)碼管顯示的閃爍數(shù) 字為機(jī)器工作轉(zhuǎn)速的出廠設(shè)定,溫控系統(tǒng)的數(shù)碼管顯示此時(shí)離心腔的溫度。(2設(shè)定機(jī)器的工作

4、參數(shù),如工作溫度,運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間,工作轉(zhuǎn)速等。(3將預(yù)先平衡好的樣品放置于轉(zhuǎn)頭樣品架上,關(guān)閉機(jī)蓋。(4按控制面板的運(yùn)轉(zhuǎn)鍵,離心機(jī)開(kāi)始運(yùn)轉(zhuǎn)。在預(yù)先設(shè)定的加速時(shí)間內(nèi),其運(yùn) 速升 至預(yù)先設(shè)定的值。(5 在預(yù)先設(shè)定的運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間內(nèi)(不包括減速時(shí)間 , 離心機(jī)開(kāi)始減速,其轉(zhuǎn)速在預(yù)先設(shè) 定的減速時(shí)間內(nèi)降至零。(6按控制面板上的停止鍵,數(shù)碼管顯示 dedT ,數(shù)秒鐘后即顯示閃爍的轉(zhuǎn)速值,這時(shí) 機(jī)器已準(zhǔn)備好下一次工作。3. 注意事項(xiàng)(1離心機(jī)應(yīng)始終處于水平位置,外接電源系統(tǒng)的電壓要匹配,并要求有良好的接地 線,機(jī)器不使用,要拔掉電源插頭。(2開(kāi)機(jī)前應(yīng)檢查轉(zhuǎn)頭安裝是否牢固,機(jī)腔中有無(wú)異物掉入。(3樣品應(yīng)預(yù)先平衡,使用離心

5、筒離心時(shí)離心筒與樣品應(yīng)同時(shí)平衡。(4揮發(fā)性或腐蝕性液體離心時(shí),應(yīng)使用帶蓋的離心管,并確保液體不外漏以 免腐蝕機(jī)腔或造成事故。(5除工作溫度、運(yùn)轉(zhuǎn)速度和運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間外,不要隨意更改機(jī)器的工作參數(shù),以免影響機(jī) 器性能。轉(zhuǎn)速設(shè)定不得超過(guò)最高轉(zhuǎn)速,以確保機(jī)器安全運(yùn)轉(zhuǎn)。(6使用中如出現(xiàn) 0.00或其它數(shù)字,機(jī)器不運(yùn)轉(zhuǎn),應(yīng)關(guān)機(jī)斷電, 10秒鐘后重新開(kāi)機(jī), 待所設(shè)轉(zhuǎn)速顯示后,再按運(yùn)轉(zhuǎn)鍵,機(jī)器將照常運(yùn)轉(zhuǎn)。(7不得在機(jī)器運(yùn)轉(zhuǎn)過(guò)程中或轉(zhuǎn)子未停穩(wěn)的情況下打開(kāi)蓋門(mén),以免發(fā)生事故。(8每次操作完畢應(yīng)做好使用情況記錄,并定期對(duì)機(jī)器各項(xiàng)性能進(jìn)行檢修。 二、電泳儀電泳技術(shù)是分子生物學(xué)研究不可缺少的重要手段。 電泳一般分為自由界面

6、電泳和區(qū) 帶電泳大類(lèi),自由界面電泳不需支持物, 如等速電泳、密度梯度電泳及顯微電泳等,這類(lèi)電 泳目前已很少使用。 區(qū)帶電泳需用各種類(lèi)型的物質(zhì)作為支持物, 常用的支持物有濾紙、 醋酸 纖維薄膜、 非凝膠性支持物、 凝膠性支持物及硅膠 G 薄層等, 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常用的 是瓊脂糖凝膠電泳。 應(yīng)用電泳法可以對(duì)不同物質(zhì)進(jìn)行定性或定量分析, 或?qū)⒁欢ɑ旌衔镞M(jìn)行 組份分析或單個(gè)組份提取制備。下面以 DYY-12型電腦三恒多用電泳儀(北京六一儀器廠 為例介紹其使用方法。1. 使用方法(1按電源開(kāi)關(guān),顯示屏出現(xiàn)“歡迎使用 DYY-12型電腦三恒多用電泳儀”等字樣后, 同時(shí)系統(tǒng)初始化,蜂鳴 4聲,設(shè)置常設(shè)置

7、。屏幕轉(zhuǎn)成參數(shù)設(shè)置狀態(tài),見(jiàn)圖一:U: 0V U =100V |Mode :STDI: 0mA I =50mA |P: 0W P =50W |T: 00:00 T =01:00 |其中 :左側(cè)大寫(xiě) U: I: P: T: 為電泳時(shí)實(shí)際值; 中間部分顯示程序的常設(shè)值 (預(yù)置值 。 Mode(模式 :STD(標(biāo)準(zhǔn) ; TIME(定時(shí) ; VH (伏時(shí) ; STEP (分步(2設(shè)置工作程序。用鍵盤(pán)輸入新的工作程序。例如,要求工作電壓 U =1000V ,電流I 限制在 200mA 以內(nèi),功率 W 限制在 100W 以內(nèi),時(shí)間 T 為 3小時(shí) 20分,并且到時(shí)間自 動(dòng)關(guān)掉輸出。則操作步驟如下:按“模式”

8、鍵,將工作模式由標(biāo)準(zhǔn)(STD 轉(zhuǎn)為定時(shí)(TIME 模 式 。 每 按 一 下 模 式 鍵 , 其 工 作 方 式 按 下 列 順 序 改 變 : STD®TIME®VH®STEP®STD。先設(shè)置電壓 U ,按“選擇”鍵,先將其反顯,然后輸入數(shù)字鍵即可設(shè)置該參數(shù)的 數(shù)值。按數(shù)字 1000, 則電壓即設(shè)置完成。設(shè)置電流 I ,按“選擇”鍵,先使 I 反顯,然后輸入數(shù)字 200。設(shè)置功率 P ,按“選擇”鍵,先使 P 反顯,然后輸入數(shù)字 100。設(shè)置時(shí)間 T ,按“選擇”鍵,先使 T 反顯,然后輸入數(shù)字 320。如果輸入錯(cuò)誤,可 以按“清除”鍵,再重新輸入。確

9、認(rèn)各參數(shù)無(wú)誤后,按“啟動(dòng)”鍵,啟動(dòng)電泳儀輸出程序。在顯示屏狀態(tài)欄中顯 示 Start! 并蜂鳴 4聲, 提醒操作者電泳儀將輸出高電壓, 注意安全。 之后逐漸將輸出電壓加 至設(shè)置值。同時(shí)在狀態(tài)欄中顯示“ Run ” ,并有兩個(gè)不斷閃爍的高壓符號(hào),表示端口已有電 壓輸出。在狀態(tài)欄最下方,顯示實(shí)際的工作時(shí)間(精確到秒 。每次啟動(dòng)輸出時(shí),儀器自動(dòng)將此時(shí)的設(shè)置數(shù)值存入“ MO ”號(hào)存儲(chǔ)單元。以后需 要調(diào)用時(shí)可以按“讀取”鍵,再按“ 0”鍵,按“確定”鍵,即可將上次設(shè)置的工作程序取 出執(zhí)行。電泳結(jié)束,儀器顯示:“ END ” ,并連續(xù)蜂鳴提醒。此時(shí)按任一鍵可止鳴。 2. 注意事項(xiàng)(1U、 I 、 P 三個(gè)

10、參數(shù)的有效輸入范圍是:U :53000V ; I :4400mA ; P :4400W.(2一般情況下,當(dāng) No Load !時(shí),首先應(yīng)關(guān)機(jī)檢查電極導(dǎo)線與電泳槽之間是否有接觸不良 的地方,可以用萬(wàn)用表的歐姆檔逐段測(cè)量。(3如果輸出端接多個(gè)電泳槽,則儀器顯示的電流數(shù)值為各槽電流之和,此時(shí)應(yīng)選擇穩(wěn)壓輸 出,以減小各槽的相互影響。(4注意保持儀器的清潔,不要遮擋儀器后方進(jìn)風(fēng)通道。嚴(yán)禁將電泳槽放在儀器頂部,避免 緩沖液灑進(jìn)儀器內(nèi)部。(5本儀器輸出電壓較高,使用中應(yīng)不避免接觸輸出回路及電泳槽內(nèi)部,以免發(fā)生危險(xiǎn)。(6長(zhǎng)期不用儀器,應(yīng)放置在干燥通風(fēng)的清潔環(huán)境中保存。三、分析天平分析天平是定量分析工作中不可缺

11、少的重要儀器,充分了解儀器性能及熟練掌握其使用方 法,是獲得可靠分析結(jié)果的保證。分析天平的種類(lèi)很多,有普通分析天平、半自動(dòng) /全自動(dòng) 電光分析天平及電子分析天平等。目前實(shí)驗(yàn)室常規(guī)備用的是自動(dòng)化程度較高的電子分析天 平。下面介紹電子分析天平 PL203/01型和 AL104/01型 (METTLER-TOLEDO的性能及使 用方法。 PL203/01型精密電子天平:最大稱量 210g ;實(shí)際分度值 0.001g ; AL104/01型高分 辨率電子分析天平:最大稱量 110g ;實(shí)際分度值 0.0001g1. 使用方法(1檢查并調(diào)整天平至水平位置。檢查電源電壓是否匹配(使用配置的穩(wěn)壓器 ,按 天

12、平儀器要求通電預(yù)熱至所需時(shí)間 30min 。(2打開(kāi)天平開(kāi)關(guān)“ on ” , 天平則自動(dòng)進(jìn)行靈敏度及零點(diǎn)調(diào)節(jié) 。待顯示屏上所有字段 短時(shí)點(diǎn)亮,天平回零時(shí),可進(jìn)行正式稱量。(3稱量時(shí)將 潔凈稱量瓶或稱量紙置于稱盤(pán) 上,關(guān)上側(cè)門(mén),天平將顯示該重量,點(diǎn)擊 “ ®O/T¬”鍵自動(dòng)校對(duì)零,然后逐漸加入待稱物質(zhì),直至所需重量為止。(4稱量結(jié)束應(yīng)及時(shí)除去稱量瓶(紙 ,關(guān)上側(cè)門(mén),切斷電源,并做好使用情況登記。 2. 注意事項(xiàng)(1天平應(yīng)放置在牢固平穩(wěn)水泥臺(tái)或木臺(tái)上,室內(nèi)要求清潔、干燥,同時(shí)應(yīng)避免光線 直接照射到天平上。(2稱量時(shí)應(yīng)從側(cè)門(mén)取放物質(zhì),讀數(shù)時(shí)應(yīng)關(guān)閉箱門(mén)以免空氣流動(dòng)引起天平擺動(dòng)。(3

13、揮發(fā)性、腐蝕性、強(qiáng)酸強(qiáng)堿類(lèi)物質(zhì)應(yīng)盛于帶蓋稱量瓶?jī)?nèi)稱量,防止腐蝕天平。(4電子分析天平若長(zhǎng)時(shí)間不使用,則應(yīng)定時(shí)通電預(yù)熱, 每周一次,每次預(yù)熱 2h ,以 確保儀器始終處于良好使用狀態(tài)。四、分光光度計(jì)不同物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)入射的吸收程度各不相同,從而形成各具特征的吸收光譜 。根據(jù)這一 原理, 應(yīng)用比色法可以對(duì)某些有色物質(zhì)進(jìn)行定性或定量分析。 但由于比色法僅限于可見(jiàn)光區(qū), 而且精度低, 已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足高精度微量分析的要求。 隨著科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展, 分析儀器也 不斷地更新?lián)Q代, 人們引進(jìn)了分光光度法的概念, 分光光度計(jì)隨之應(yīng)用。 分光光度計(jì)由光源、 單色器、吸收池、接受器、顯示屏幕所組成,它不僅適應(yīng)于可見(jiàn)

14、光區(qū),同時(shí)還擴(kuò)展至紫外光 區(qū)及紅外光區(qū)。光密度(OD 是許多溶液中的溶質(zhì)定量的指標(biāo)之一,通過(guò)所產(chǎn)生的單色光而測(cè)定某一溶液對(duì)該單色光的吸收值。 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行核酸溶 液定量和純度的初步判斷 。下面介紹紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì) GeneQantTM Pro(Amersham 的使用方法。 該儀器除了能 檢測(cè)核酸樣品濃度外 , 還可進(jìn)行 蛋白質(zhì)濃度以及細(xì)胞培養(yǎng)液濃度 的測(cè)定,能檢測(cè)低至幾微升樣品(70µl 和 57µl ,樣品無(wú)需稀釋,測(cè)量后還可全部回收。使用方法(1打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)(ON ,等待數(shù)秒鐘,顯示屏上顯示一系列數(shù)據(jù),如本機(jī)型號(hào)、當(dāng)前日期 等,這些數(shù)據(jù)

15、可以重新設(shè)置,當(dāng)出現(xiàn)“ instrument Ready ”即可進(jìn)入下一程序。(2在儀器面板上有許多功能鍵,其中包括檢測(cè) base sep 、 Tm 、 DNA 、 RNA 、 oligo 、 Protein595assay 、 Protein280 meas、 cell culture等。例如,欲檢測(cè) DNA , 按 DNA 鍵,即進(jìn) 入 DNA 檢測(cè)程序。在顯示屏上:Pathlengh 10mmUnits µg/µl Use 320nm NODilution Faotor 1Insert reference,以上為儀器預(yù)設(shè)置的參考數(shù)據(jù),若按“ enter ”鍵,和“ s

16、elect ”鍵可以將以上的參數(shù)進(jìn)行重 新設(shè)定。(3取石英樣品杯 70µl 或 57µl ,容量大小根據(jù)需要。先用吸管吸高純水入樣品杯中,然 后放入儀器上的樣品槽中,放入時(shí)注意樣品杯的光學(xué)面朝前方。(4按“ set ref ”鍵,進(jìn)行空白測(cè)試。顯示屏上出現(xiàn)一系列數(shù)據(jù)均“ 0.000”并提示插入樣品 “ Insert sample ” 。將樣品杯取出,吸干水分,稍干燥后,同樣吸入待測(cè)樣品,放入樣品槽 中進(jìn)行測(cè)定。(5一個(gè)樣品測(cè)定完畢,按“ stop ”鍵,返回“ Instrument Ready” 。(6取出樣品杯,吸出樣品,然后用高純水洗幾次,自然晾干。由于樣品杯十分昂貴,

17、使用 時(shí)要小心操作。 不能用手指拿樣品杯的光學(xué)面,用后要及時(shí)洗滌, 可用溫水或稀鹽酸, 乙醇 以至鉻酸洗液(濃酸中浸泡不要超過(guò) 15分鐘 ,表面只能用柔軟的絨布或拭鏡頭紙擦凈。五、數(shù)字式酸度計(jì)酸度計(jì)是實(shí)驗(yàn)室配置溶液必備的儀器。本實(shí)驗(yàn)室的酸度計(jì)為臺(tái)式微電腦酸堿度計(jì)和 溫度計(jì)(Hanna , 測(cè)量 pH 范圍為 0.0014.00pH ;溫度為 0.0100.0 ;1. 使用方法(1將 pH 電極和溫度探頭與主機(jī)連接,主機(jī)與電源連接。(2取出電極保護(hù)套, 如果有結(jié)晶鹽出現(xiàn),這是電極常見(jiàn)現(xiàn)象,浸入水后就會(huì)消逝。如 果薄膜玻璃或透析膜發(fā)干,可在 HI170300電極保存液中浸泡 1小時(shí) 。(3 pH

18、校準(zhǔn)。 將 pH 電極和溫度探棒浸泡在所選的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液內(nèi) 4cm (建議用 pH6.86、 7.01 , 緩沖液值可通過(guò) “ D ” 或 “ Ñ” 鍵來(lái)調(diào)節(jié)。 按 “ CAL ” 鍵, 儀器將顯示 “ CAL ” 和 “ BUF ” 符號(hào)及“ 7.01”數(shù)據(jù)。當(dāng)讀數(shù)不穩(wěn)定時(shí),屏幕會(huì)顯示“ NOTREADY ” ;當(dāng)讀數(shù)穩(wěn)定時(shí),屏幕 會(huì)顯示“ READY ”和“ CFM ” ,按“ CFM ”鍵確認(rèn)校準(zhǔn)值。 確認(rèn)第一校準(zhǔn)點(diǎn)后 ,將 pH 電極 與溫度探棒浸泡在標(biāo)準(zhǔn)緩沖液內(nèi) 4cm (建議用 pH4.01、 9.18、 10.01 ;再按“ CAL ”鍵,儀 器將顯示“ CAL ”和“

19、BUF ”符號(hào)及“ 4.01”數(shù)據(jù)。按“ CFM ”鍵確認(rèn)校正值。(4 pH 測(cè)量。校準(zhǔn)完畢后,儀器自動(dòng)進(jìn)入 pH 測(cè)量狀態(tài),將電極與溫度探棒浸泡在待測(cè) 溶液約 4cm ,停幾分鐘讓電極讀數(shù)穩(wěn)定 。2. 注意事項(xiàng)(1由于 pH211酸度計(jì)內(nèi)裝有可充電電池,在剛購(gòu)買(mǎi)或長(zhǎng)時(shí)間放置后,再使用時(shí),通電 校正測(cè)量完畢后,可將電源繼續(xù)還插入電源插座,只需關(guān)閉開(kāi)關(guān),這樣可以保證電池充電, 是校正值得以儲(chǔ)存,下次測(cè)量時(shí)無(wú)須校正即可進(jìn)入精確測(cè)量。(2不可用蒸餾水、去離子水和純水浸泡電極。如果讀數(shù)偏差太大(±1pH ,則是由于 沒(méi)有校正或電極變干。為避免電極受損,在關(guān)機(jī)前要將 pH 電極從溶液中拿出。當(dāng)

20、處于關(guān)機(jī) 狀態(tài)時(shí),在電極浸入電極保存液前,電極要與機(jī)器分開(kāi)。(3 如儀器已測(cè)過(guò)幾種不同的樣品溶液,請(qǐng)用自來(lái)水清洗, 或在插入樣品溶液前,用待測(cè) 樣品清洗電極。(4溫度會(huì)影響 pH 的讀數(shù),為測(cè)量準(zhǔn)確的 pH 值, 溫度要在適合的范圍內(nèi)進(jìn)行自動(dòng)溫度 補(bǔ)償,用 HI7669/2W溫度探棒浸入樣品中, 緊靠電極并停幾分鐘 ,如果被測(cè)溶液的溫度已 知或測(cè)量是在相同溫度下進(jìn)行, 只需動(dòng)手補(bǔ)償, 那么此時(shí)溫度探棒是不用連接, 屏幕上會(huì)顯 示溫度讀數(shù)伴有信號(hào)閃爍。溫度可通過(guò)“ Ñ”或“ D ”來(lái)調(diào)節(jié)。六、 PCR 儀PCR 儀,也稱 DNA 熱循環(huán)儀、基因擴(kuò)增儀,它是使一對(duì)寡核苷酸引物結(jié)合到正負(fù)

21、DNA 鏈 上的靶序列兩側(cè),從而酶促合成拷貝數(shù)為百萬(wàn)倍的靶序列 DNA 片段,它的每一循環(huán)包括在 三種不同溫度進(jìn)行 DNA 變性、引物復(fù)性、 DNA 聚合酶催化的延伸反應(yīng)的三個(gè)過(guò)程。PCR 儀主要應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究等許多領(lǐng)域,如基因分析、序列分析、進(jìn)化分析、 臨床診斷、法醫(yī)學(xué)等等。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展, PCR 擴(kuò)增技術(shù)也得到普及推廣應(yīng)用,因此了解 PCR 儀的性能,熟練掌握儀器的正確使用方法及使用過(guò)程中的注意事項(xiàng),將是十 分必要的。現(xiàn)介紹 PCR 擴(kuò)增儀(Tl Thermocycler的使用方法和注意事項(xiàng)。1. 使用方法(1接通電源開(kāi)關(guān),儀器進(jìn)入準(zhǔn)備狀態(tài);在顯示屏上記錄了當(dāng)前儀器的

22、溫度和蓋子(Lid 的溫度。 若儀器正在運(yùn)行時(shí), 須按 “ B ” 鍵 (start/stop , 才能退出運(yùn)行并返回準(zhǔn)備狀態(tài)。(2編寫(xiě)程序段。在準(zhǔn)備狀態(tài)下按“ C ”鍵 (programs進(jìn)入編程狀態(tài),選定一程序號(hào),然 后按“ enter ”鍵,進(jìn)入下一程序;按 “ A ” (list鍵后,選一文件號(hào)(empty program ;再按 “ enter ”鍵,進(jìn)入下一程序;按“ ABC ”鍵,進(jìn)入下一程序,用上下左右鍵號(hào)選擇一個(gè)字 母(A 、 B 、 C 、 D 、 ,然后按“ enter ”鍵,進(jìn)入下一程序;按“ name ok”鍵,完成文件 命名。(3設(shè)定蓋子的溫度。 “ lid tem

23、p :” ,蓋子的溫度一般比變性溫度要高 10,例如變 性溫度是 95,那么蓋子的溫度就要設(shè)定為 105。待蓋子預(yù)熱后按“ enter ”鍵,進(jìn)入下一 程序。(4設(shè)定變性溫度、變性時(shí)間、延伸溫度、延伸時(shí)間、退火溫度、退火時(shí)間及循環(huán)總數(shù)等參 數(shù)。從第一步依次按“ enter ”鍵進(jìn)入,用四個(gè)移位鍵移動(dòng)設(shè)定位置。先設(shè)定溫度,后設(shè)定時(shí) 間,全部參數(shù)設(shè)置完后,按“ pgm ok”鍵,所設(shè)定的程序自動(dòng)被保存。(5運(yùn)行程序。檢查設(shè)定是否正確, 按“ start ”鍵,選擇設(shè)定好的程序,開(kāi)始運(yùn)行。顯示 屏上可觀察到系統(tǒng)運(yùn)行的情況,按“ Stop ”可停止運(yùn)行。七、凝膠成像系統(tǒng)本系統(tǒng)屬全自動(dòng)電腦控制影像分析系

24、統(tǒng),主要拍攝核酸的 agarose 電泳膠片,及蛋白質(zhì)的 acrylamide 電泳膠片。在與 markers 比較后,可精確計(jì)算樣本的分子量,對(duì)核酸電泳也可準(zhǔn) 確定量,是分子生物學(xué)及生化蛋白試驗(yàn)的重要檢測(cè)工具。 本系統(tǒng)包括暗箱, 紫外透射儀,攝 像頭,變焦鏡,電腦以及專(zhuān)業(yè)凝膠圖象采集及分析 . 軟件(3.3版 。該軟件提供對(duì)電泳凝膠、 斑點(diǎn)測(cè)量、 PCR 密度的定量分析等。此外,還提供圖像采集、標(biāo)注、打印、數(shù)據(jù)和圖像發(fā) 送到 Word 、 Excel 、圖像處理等功能。1. 使用方法(1 打開(kāi)電腦,啟動(dòng)凝膠分析軟件,進(jìn)入用戶界面。(2打開(kāi)采集凝膠圖像的暗箱裝置電源開(kāi)關(guān),放入凝膠,打開(kāi)紫外光源

25、或白光光源, 將采集裝置與電腦上采集卡相連,然后選擇“文件”菜單中的“圖像采集”或工具欄的“圖 像采集”按鈕,出現(xiàn)圖像窗口:“開(kāi)始采集” 、 “停止采集” 、 “采集圖像”等。如果圖像不清 晰,可以調(diào)節(jié)暗箱上的變焦鏡,使之清晰?？芍苯訉D像保存起來(lái),也可通過(guò)“圖像處理”對(duì)圖像進(jìn)行旋轉(zhuǎn)、裁剪、濾波、調(diào)節(jié)對(duì)比度方面的處理。(3對(duì)讀入的電泳凝膠圖像,可以啟動(dòng)電泳凝膠分析系統(tǒng)。在“功能選擇”菜單中選 擇“電泳凝膠”或在工具欄上的“電泳凝膠”工具,將出現(xiàn)泳道分析工具欄,并在“圖像顯 示”子窗口中出現(xiàn)一個(gè)紅色的矩形框。還可進(jìn)入“條帶分析”系統(tǒng),對(duì)條帶 進(jìn)行編號(hào),對(duì) 二條以上的條帶進(jìn)行比較。(4 采集圖像結(jié)

26、束后, 關(guān)閉暗箱電源開(kāi)關(guān), 從暗箱中取出凝膠, 并將玻璃板清洗干凈, 晾干。八、空氣恒溫?fù)u床搖床(振蕩器為實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)設(shè)備。 SHK-99-型臺(tái)式空氣恒溫?fù)u床,采用微電腦控制系 統(tǒng), 溫度范圍:室溫+560,精度±0.5;時(shí)間范圍:1分鐘99小時(shí) 59分鐘;轉(zhuǎn) 速范圍:60RPM 250RPM 。1. 使用方法(1 LED 屏幕上各段數(shù)據(jù):RPM Temp Time1 000 00.0 00:00屏幕上“ 1”表示第一段,如果是第二段則為“ 2” , “ Temp ”表示溫度, “ RPM ”表示每分鐘 轉(zhuǎn)速, “ Time ”表示時(shí)間,不設(shè)定時(shí)可自動(dòng)累計(jì)時(shí)間一直運(yùn)行。 “ Temp

27、 ” 、 “ RPM ” 、 “ Time ” 的值隨時(shí)可以修改,隨時(shí)按新值運(yùn)行。(2工作程序設(shè)置。按“ F1”鍵,進(jìn)入設(shè)置狀態(tài)?？稍谒俣?溫度,時(shí)間,運(yùn)行等四部分之 間切換。在每一部分按“ F2”鍵輸入數(shù)據(jù),輸入完十位數(shù)據(jù),再輸入個(gè)位數(shù)據(jù),按“ F2” 鍵,再按“ F2”鍵,到小數(shù)位,再按“ F2”鍵,又到十位,以此循環(huán)。(3再按“ F1”鍵,轉(zhuǎn)回運(yùn)行狀態(tài),按“ Start ”鍵,電機(jī)開(kāi)始運(yùn)行,時(shí)間開(kāi)始計(jì)時(shí)。(4按“ End ”鍵,結(jié)束系統(tǒng)運(yùn)行。2. 注意事項(xiàng)(1打開(kāi)電源,系統(tǒng)開(kāi)始自檢,等待 LCD 屏幕出現(xiàn)“ WELCOME ”字樣,系統(tǒng)自檢 完畢,可以進(jìn)行第 2步參數(shù)設(shè)置。若屏幕出現(xiàn):a

28、. “ TEMP ERROR ” ,表示溫度檢測(cè)線路有 錯(cuò)誤; b. “ MOTOR ERROR” ,表示電機(jī)部分有錯(cuò)誤。(2運(yùn)行過(guò)程可以打開(kāi)箱蓋,這樣電機(jī)不運(yùn)行,時(shí)間也停止,蓋上蓋接著運(yùn)行。(3工作完畢,關(guān)閉電源。關(guān)機(jī)后,要等一段時(shí)間再開(kāi)機(jī)。九、水的凈化裝置分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)水的純度要求越來(lái)越高, 一般蒸餾水常常難以滿足實(shí)驗(yàn)要求, 大多要求要 進(jìn)行第二次蒸餾(雙蒸水 ,它可以去除水中的大部分有機(jī)雜質(zhì),但制作時(shí)間較長(zhǎng),而且無(wú) 機(jī)雜質(zhì)還是很多。許多實(shí)驗(yàn)還需要去離子水,這就需要陰陽(yáng)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行處理。目前, 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室都使用高質(zhì)量的超純水。如美國(guó)微孔濾膜公司的 Milli-Q 超純水制造系統(tǒng)

29、 所制造的超純水適用于許多學(xué)科領(lǐng)域,如分子克隆、各種色譜分析、氨基酸分析、 DNA 測(cè) 序、酶反應(yīng)、組織和細(xì)胞培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)。下面介紹 RO-MB 壁掛式反滲透高純水機(jī)性能及使用 方法。 RO-MB 反滲透高純水機(jī)(杭州永潔達(dá)產(chǎn)水量(25 10L/H;產(chǎn)水水質(zhì):RO 純水: <10s/cm,高純水:>15M.cm ;可用自來(lái)水制成普通實(shí)驗(yàn)用水和高純水,同時(shí)滿足不同 水質(zhì)要求。在線電導(dǎo)率儀對(duì)產(chǎn)水水質(zhì)連續(xù)檢測(cè),可保證產(chǎn)水質(zhì)量。1. 使用方法(1準(zhǔn)備:先檢測(cè)與純水機(jī)相連的原水管路、廢水管路連接是否正常,打開(kāi)原水閥門(mén)。供電 電源是否正常,檢查按鈕是否在關(guān)閉狀態(tài)(按鈕彈出狀態(tài) 。將電源插頭插入帶

30、有接地線的 220V 電源插座上。(2開(kāi)機(jī):依次按下電源開(kāi)關(guān),泵開(kāi)關(guān),純水機(jī)啟動(dòng)產(chǎn)水,同時(shí)廢水排出,指示燈亮起,并 處于自動(dòng)運(yùn)行狀態(tài)。(3取純水:若打開(kāi) RO 純水或高純水出口閥門(mén),則可獲得相應(yīng)水質(zhì)的純水。當(dāng)高純水出口 閥門(mén)打開(kāi)時(shí), 檢測(cè)儀表顯示高純水電導(dǎo)率或電阻值。 為了獲得高質(zhì)量的高純水, 可以先放掉 一杯水后再取新鮮水。(4關(guān)機(jī):不用時(shí)可關(guān)閉個(gè)按鈕停機(jī),自來(lái)水進(jìn)水閥門(mén)不必關(guān)閉,這時(shí)機(jī)子內(nèi)部的進(jìn)水電磁 閥已自動(dòng)切斷水路。只要管路閥門(mén)不漏,也可使機(jī)子保持自動(dòng)待機(jī)狀態(tài)。2. 注意事項(xiàng)(1純水機(jī)的正常使用環(huán)境溫度為 1535,產(chǎn)水量會(huì)隨溫度降低而下降,冬季保養(yǎng)溫 度不低于 5。(2 預(yù)處理濾芯一

31、般三至六個(gè)月更換一次,實(shí)際使用壽命與自來(lái)水水質(zhì)、總過(guò)濾量等有 關(guān)。(3 混床濾芯產(chǎn)高純水約 13噸, 約二至四個(gè)月更換一次, 實(shí)際使用壽命與自來(lái)水水質(zhì)、 水中含鹽量、總用水量等有關(guān)。 設(shè)備停運(yùn)時(shí)間超過(guò) 2天。 必須注意定期沖洗維護(hù)。夏季宜每 天開(kāi)機(jī) 30分鐘沖洗一次,冬季每隔 23天開(kāi)機(jī)沖洗一次。(4使用過(guò)程若發(fā)現(xiàn)停機(jī)后泵仍頻繁地每隔數(shù)分鐘有規(guī)則地啟動(dòng)數(shù)秒鐘又停機(jī),此為管 路漏水引起, 需及時(shí)打開(kāi)機(jī)箱加以解決。 若每隔半小時(shí)以上啟動(dòng)數(shù)秒鐘又停機(jī), 乃屬正?，F(xiàn)象, 有利于沖洗和保護(hù)反滲透膜元件, 避免遭到微生物繁殖和減少污物沉積, 尤其高溫季節(jié)。 十、消毒設(shè)備細(xì)菌和細(xì)胞培養(yǎng)以及核酸等有關(guān)實(shí)驗(yàn)所用

32、的試劑、 器皿及實(shí)驗(yàn)用具, 應(yīng)嚴(yán)格滅菌, 有的實(shí)驗(yàn) 還要求沒(méi)有核酸酶的污染,故應(yīng)將實(shí)驗(yàn)器械,試劑等進(jìn)行高壓消毒。對(duì)于經(jīng)過(guò)導(dǎo)入 DNA 重 組分子的菌株,操作后必須進(jìn)行嚴(yán)格的高壓消毒滅活處理。大批實(shí)驗(yàn)物品、 試劑、培養(yǎng)基等可以使用大型消毒器進(jìn)行消毒。一些不能經(jīng)受高壓、高溫消 毒的試劑可用濾器濾膜除菌,器皿可用紫外線照射、 75%乙醇或 0.1%的十二烷基硫酸鈉 (SDS 浸泡消毒。所有的細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)菌培養(yǎng)的操作,都應(yīng)在紫外線消毒后的超凈工作臺(tái) 中進(jìn)行。下面介紹立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器(LDZX-40BI 的使用方法。1. 使用方法(1開(kāi)蓋:轉(zhuǎn)動(dòng)手輪,使鍋蓋離開(kāi)密封圈。(2通電:連接自動(dòng)進(jìn)水裝置。接

33、通電源,將控制面板上電源開(kāi)關(guān)按至 ON 處,若水位 低(LOW 紅燈亮,蒸發(fā)鍋內(nèi)屬斷水狀態(tài);缺水(LACK 黃燈亮,電源已正常輸入。(3加水:打開(kāi)水源,水位達(dá)到低水位,控制面板上低水位紅燈和缺水黃燈相繼滅,加 熱(1-綠燈亮,繼續(xù)加水至高水位(HIGH 綠燈亮,自動(dòng)停止加水。(4堆放物品:需包扎的滅菌物品,體積不超過(guò) 200mm ×100mm ×100mm 為宜,各 包裝之間留有間隙,堆放在金屬框內(nèi),這樣有利于蒸汽的穿透,提高滅菌效果。(5密封高壓鍋:推橫梁入立柱內(nèi),旋轉(zhuǎn)手輪,使鍋蓋下壓,充分壓緊。(6設(shè)定溫度:通電后數(shù)顯窗燈亮,上層為紅色,顯示溫度,下層為綠色,設(shè)定溫度

34、和時(shí)間。先按控制面板上確認(rèn)鍵,綠色數(shù)顯閃爍,進(jìn)入溫度設(shè)定狀態(tài)。按一次移位鍵 所 指相應(yīng)位置閃爍,根據(jù)所需數(shù)據(jù)位置進(jìn)行(單項(xiàng)循環(huán)移位。按增加鍵或 ? 減少鍵,進(jìn)行 所需溫度設(shè)定。設(shè)定完畢,按二次確認(rèn)鍵,進(jìn)行溫度確認(rèn)。(7設(shè)定時(shí)間:按一次確認(rèn)鍵,將溫度設(shè)定切換成時(shí)間設(shè)定;再按一次移位鍵,所指 相應(yīng)位置閃爍, 根據(jù)所需數(shù)據(jù)位置進(jìn)行移位; 按增加鍵或減少鍵, 進(jìn)行所需時(shí)間設(shè)定。 設(shè)定 完畢, 按二次確認(rèn)鍵, 進(jìn)行時(shí)間設(shè)定確認(rèn)。 時(shí)間采用倒計(jì)時(shí), 當(dāng)滅菌鍋內(nèi)溫度達(dá)到設(shè)定溫度, 定時(shí)器開(kāi)始倒計(jì)時(shí)。(8滅菌:在加熱初,將下排汽閥打開(kāi)至垂直位置;下排汽閥待蒸汽冒出時(shí),壓力表 顯示指示為 100時(shí),將下排汽閥推

35、向水平關(guān)閉位置;留有微量蒸汽逸出,以控制總汽流量 的 15%為宜。 使用最高滅菌溫度為 124126, 壓力在 0.145Mpa 0.165Mpa 范圍內(nèi)屬于 安全閥設(shè)定數(shù),超出壓力部分,安全閥將自動(dòng)泄壓,并開(kāi)始計(jì)數(shù)滅菌所需時(shí)間。滅菌完成,電控裝置將自動(dòng)關(guān)閉加熱系統(tǒng),伴有蜂鳴提醒;并將保溫時(shí)間切換成 END 顯示;此時(shí),將 控制面板上電源開(kāi)關(guān)按至 OFF 處;關(guān)閉電源,停止加熱待其冷卻。(9干燥:物品滅菌后需要迅速干燥,須打開(kāi)放汽閥和下排汽閥,將滅菌器內(nèi)的蒸汽迅 速排出,使物品上殘留水蒸汽快速揮發(fā)。(10將蓋開(kāi)啟,取出已滅菌物品。關(guān)閉水源,打開(kāi)下排水閥,排盡滅菌室的水與水垢, 以備下次使用。2

36、. 注意事項(xiàng)(1堆放滅菌物品時(shí),嚴(yán)禁堵塞安全閥的出汽孔,必須留出空位保證其空氣暢通,否則 安全閥因出汽孔堵塞不能工作,造成事故。(2滅菌液體時(shí),應(yīng)將液體灌裝在硬制的耐熱玻璃瓶中,以不超過(guò) 3/4體積為好,瓶口 選用棉花紗塞, 切勿使用未打孔的橡膠或軟木塞, 特別注意, 在滅菌液體結(jié)束時(shí)不準(zhǔn)立即釋 放蒸汽,必須待壓力表指針回零位方可排放余汽。(3對(duì)不同類(lèi)型,不同滅菌物要求的物品,切勿放在一起滅菌,以免顧此失彼,造成損 失。實(shí)驗(yàn)二 質(zhì)粒 DNA 的提取-堿裂解法一、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)菌質(zhì)粒是一類(lèi)雙鏈、閉環(huán)的 DNA ,大小范圍從 1kb 至 200kb 以上不等。各種質(zhì)粒都是存 在于細(xì)胞質(zhì)中、 獨(dú)立于細(xì)胞

37、染色體之外的自主復(fù)制的遺傳成份, 通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處 于染色體外的游離狀態(tài), 但在一定條件下也會(huì)可逆地整合到寄主染色體上, 隨著染色體的復(fù) 制而復(fù)制,并通過(guò)細(xì)胞分裂傳遞到后代。一般分離質(zhì)粒 DNA 的方法都包括 3個(gè)步驟:培養(yǎng)細(xì)菌,使質(zhì)粒 DNA 大量擴(kuò)增;收集 和裂解細(xì)菌;分離和純化質(zhì)粒 DNA 。分離制備質(zhì)粒 DNA 的方法很多,其中常用的方法 有堿裂解法、煮沸法、 SDS 法、羥基磷灰石層析法等。在實(shí)際操作中可以根據(jù)宿主菌株類(lèi) 型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成和結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)以及質(zhì)粒 DNA 的用途進(jìn)行選擇。本實(shí)驗(yàn)介紹堿 裂解法提取質(zhì)粒 DNA 。堿裂解法提取質(zhì)粒 DNA 是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀

38、質(zhì)粒 DNA 和線性染色體 DNA 在拓?fù)鋵W(xué)上的差 異來(lái)分離質(zhì)粒 DNA 。在 pH 值介于 12.0-12.5這個(gè)狹窄的范圍內(nèi),線性的 DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu) 解開(kāi)而被變性,盡管在這樣的條件下,共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒 DNA 的氫鍵會(huì)被斷裂,但兩條互補(bǔ)鏈 彼此相互盤(pán)繞, 仍會(huì)緊密地結(jié)合在一起。 當(dāng)加入 pH4.8乙酸鉀高鹽緩沖液恢復(fù) pH 至中性時(shí), 因?yàn)楣矁r(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒 DNA 的兩條互補(bǔ)鏈仍保持在一起,因此復(fù)性迅速而準(zhǔn)確,而線性 的染色體 DNA 的兩條互補(bǔ)鏈彼此已完全分開(kāi),復(fù)性就不會(huì)那么迅速而準(zhǔn)確,它們相互纏繞 形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),而復(fù)性的質(zhì)粒 DNA 恢復(fù)原來(lái)構(gòu)型,保持可溶性狀態(tài)。通過(guò)離心,染

39、色體 DNA 與不穩(wěn)定的大分子 RNA ,蛋白質(zhì) -SDS 復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去,最后用 酚氯仿抽提純化上清液中的質(zhì)粒 DNA 。二、儀器及試劑1. 儀器及耗材:37恒溫?fù)u床、冷凍離心機(jī)、臺(tái)式離心機(jī)、微量移液器、 50 ml離心管、 1.5 ml離心管管、槍頭、各種規(guī)格的量筒、接種環(huán)、試劑瓶、 100 l或者 250 ml三角瓶、玻 棒等。2. 試劑及配制:LB 培養(yǎng)液的配制:酵母浸提物 5.0 g;胰蛋白胨 10.0 g;NaCl 10.0 g;依次稱量后加入 800 ml去離子水后攪拌至完全溶解,用 5 mol/L NaOH(約 0.2 ml調(diào)節(jié)培 養(yǎng)液的 pH 值至 7.0。再加

40、去離子水將溶液定容至總體積為 1000 ml, 10磅高壓滅菌 20 min, 冷卻后 4保存。溶液 (GET 緩沖液 :25 mmol/LTris-HCl(pH8.0 , 10 mmol/L EDTA, 50 mmol/L 葡萄糖配制:1000 ml1 mol/L Tris-HCl(pH8.0 25 ml0.5 mol/L EDTA(pH8.0 20 ml20% Glucose(1.11mol/L 45 mldH2O910ml將以上溶液混合裝瓶, 10磅高壓滅菌 20 min,冷卻后 4保存。溶液 II (變性液 :200 mmol/L NaOH , 1% SDS配制:500 ml10% S

41、DS 50 ml2N NaOH 50 ml取以上溶液,用滅菌去離子水定容至 500 ml ,充分混勻。室溫保存,此溶液保存時(shí)間最好 不超過(guò)一個(gè)月,最好現(xiàn)用現(xiàn)配。注意:SDS 易產(chǎn)生氣泡,不要?jiǎng)×覕嚢?。溶?III (醋酸鉀液 :3 mol/L 醋酸鉀(KAc 緩沖液, pH 5.6。 5 mol/L 冰醋酸配制:500 ml醋酸鉀 147 g冰醋酸 57.5 ml加入 300 ml去離子水后攪拌溶解。待醋酸鉀溶解后,再加去離子水將溶液定容至 500 ml。 高溫高壓滅菌后, 4保存。10×TE 緩沖液(pH 8.0 :100 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L ED

42、TA配制:1000ml1 mol/LTris-HCl 緩沖液 (pH 8.0 100ml500 mmol/L EDTA (pH8.0 20 ml加入約 800 ml的去離子水,均勻混合。溶液定容至 1 L。高溫高壓滅菌后, 4保存。苯酚 /氯仿 /異戊醇 (25 : 24 : 1:將量取 25 ml Tris-HCl(pH8.0平衡苯酚,加入 24 ml 氯仿 和 1 ml 異戊醇,充分混合后,移入棕色玻璃瓶中, 4保存。其它試劑:TE (pH8.0 、異丙醇、氯仿 /異戊醇(24:1 、無(wú)水乙醇、 70%乙醇、氨卞青霉素 貯存液(50 mg/ml三、操作步驟1. 菌體的培養(yǎng)和收獲(1將 51

43、0 ml 含有氨卞青霉素(AP 的 LB 培養(yǎng)基加入到容量為 100ml 的三角瓶中,然 后接入一單菌落,并保持通氣良好,于 37 220 rpm 振搖過(guò)夜培養(yǎng)(約 16h 后可以再轉(zhuǎn) 接一次,于 37 220 rpm振搖培養(yǎng) 34 h。(2 吸取培養(yǎng)的菌液 1.5 ml, 轉(zhuǎn)入 1.5 ml的離心管中, 用臺(tái)式離心機(jī)以 12000 rpm離心 3 min。 棄上清,將離心管倒置,使液體盡可能流盡。2. 質(zhì)粒 DNA 提取(堿裂解法(1加 100 ul 溶液 重懸細(xì)菌沉淀,用槍吹打直至混和均勻。(2 加 200 ul溶液 , 蓋緊管口, 輕緩上下顛倒離心管以混合內(nèi)容物。 室溫靜置 5 min(

44、溶 液變透明,粘稠 。(3加 150 ul溶液 ,輕微振蕩混和 10 sec,置冰上 10 min (溶液出現(xiàn)白色沉淀 。(4 12000 rpm離心 6 min,取上清液至另一離心管(棄沉淀 。(5加等量的酚 /氯仿 /異戊醇,旋渦混勻 1 min , 12000 r/min離心 6min ,取上清液至另一 離心管。(6加 1倍異丙醇,振蕩混勻,靜置 10 min, 12000 rpm離心 6 min。棄上清液,將離心管 倒置于吸水紙,將附于管壁的殘余液滴除凈。(7加 200 ul 70%乙醇洗滌沉淀物,臺(tái)式離心機(jī) 12000 rpm離心 2 min,棄上清液,將沉淀 在室溫下晾干(或在 5

45、0-60的烘箱中也可 。(8沉淀加 20l TE, 反復(fù)吹打使質(zhì)粒 DNA 充分溶解,-20保存。四、常見(jiàn)問(wèn)題及可能原因1. 提取的質(zhì)粒 DNA 不純:變性不充分;關(guān)鍵步驟反應(yīng)時(shí)間過(guò)短;離心時(shí)間或速度不夠。2. 提取的質(zhì)粒 DNA 呈涂布狀:操作過(guò)程中用力過(guò)猛,動(dòng)作過(guò)大;操作系統(tǒng)內(nèi)有污染。3. 與染色體 DNA 分離不全:變性過(guò)程不完全;試劑配制有問(wèn)題(成分,濃度或 pH 。實(shí)驗(yàn)三 瓊脂糖凝膠電泳一、實(shí)驗(yàn)原理瓊脂糖凝膠電泳是分離和純化 DNA 片段的常用技術(shù)。把 DNA 樣品加入到一塊包含電解質(zhì) 的多孔支持介質(zhì)(瓊脂糖凝膠的樣品孔中,并置于靜電場(chǎng)上。由于 DNA 分子的雙螺旋骨 架兩側(cè)帶有含負(fù)

46、電荷的磷酸根殘基, 因此在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。 在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下, DNA 分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)。 具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量的 DNA 片段泳動(dòng)速度不一樣, 因而可依據(jù) DNA 分子的大小來(lái)使其分離。凝膠電泳不僅可分離不同分子質(zhì)量的 DNA , 也 可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同,而構(gòu)型不同的 DNA 分子。在電泳過(guò)程中可以通過(guò)示蹤染料或 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參照物和樣品一起進(jìn)行電泳而得到檢測(cè)。 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參照物相對(duì)可 以提供一個(gè)用于確定 DNA 片段大小的標(biāo)準(zhǔn)。 在凝膠中加入少量溴化乙錠 (ethidium bromide, EB ,其分子可插入 DNA 的堿基之間,形成一種絡(luò)合物,在

47、254365nm 波長(zhǎng)紫外光照射 下,呈桔紅色熒光,因此也可對(duì)分離的 DNA 進(jìn)行檢測(cè)。一般瓊脂糖凝膠電泳適用于大小在 0.2kb 50kb 范圍內(nèi)的 DNA 片段。本實(shí)驗(yàn)介紹瓊脂糖凝 膠的制備以及瓊脂糖凝膠電泳在 DNA 片段分離中的應(yīng)用方法。二、儀器及試劑1. 儀器及耗材:水平電泳槽、 電泳儀、 凝膠成像分析系統(tǒng)、 微波爐、 微量移液器、 透明膠帶、 點(diǎn)樣板或 parafilm 、 100 ml或 250 ml錐形瓶、量筒、吸頭等。2. 試劑及配制:50×TAE 緩沖液的配制:2 mol/L Tris-乙酸, 0.05 mol/L EDTA(pH 8.0配制 1000 mlTri

48、s 242 g冰乙酸 57.1 ml0.5 mol/L EDTA 100 ml加入 600 ml去離子水后攪拌溶解,將溶液定容至 1 L后。高溫高壓滅菌,室溫保存。 1×TAE 緩沖液的配制:稱量 20 ml的 50×TAE 緩沖液,再加入 980 ml的去離子水。溴化乙啶貯存液:10 mg/ml 溴化乙啶配制:100 ml稱取 1 g 溴化乙啶,置于 100 ml 燒杯中,加入 80 ml 去離子水后攪拌溶解。將溶液定容至 100 ml后,轉(zhuǎn)移到棕色瓶中。室溫保存。6×上樣緩沖液:0.25%溴酚藍(lán), 0.25%二甲苯青 FF , 30%甘油。配制:10 ml溴酚

49、藍(lán) 25 mg二甲苯青 FF 25 mg甘油 3 ml用 6×TAE 緩沖液定溶至 10 ml,分裝成 1 ml/管。 -20保存。其它試劑:DNA 樣品、 DNA Ladder 、瓊脂糖、三、操作步驟1. 制備 1%瓊脂糖凝膠 (大膠用 70ml ,小膠用 50ml :稱取 0.7 g(0.5 g瓊脂糖置于錐形瓶 中, 加入 70 ml(50ml 1×TAE , 瓶口倒扣小燒杯。 微波爐加熱煮沸 3次至瓊脂糖全部融化, 搖勻,即成 1.0%瓊脂糖凝膠液。2. 膠板制備:取電泳槽內(nèi)的有機(jī)玻璃內(nèi)槽(制膠槽洗干凈、晾干,放入制膠玻璃板。取 透明膠帶將玻璃板與內(nèi)槽兩端邊緣封好,

50、形成模子。 將內(nèi)槽置于水平位置, 并在固定位置放 好梳子。將冷卻到 65左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內(nèi)槽玻璃板上,使膠液緩慢展 開(kāi),直到整個(gè)玻璃板表面形成均勻膠層。 室溫下靜置直至凝膠完全凝固,垂直輕拔梳子,取 下膠帶,將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中。添加 1×TAE 電泳緩沖液至沒(méi)過(guò)膠板為止。3. 加樣:在點(diǎn)樣板或 parafilm 上混合 DNA 樣品和上樣緩沖液, 上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù) 應(yīng)不小于 1X 。 用 10 ul微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi), 每加完一個(gè)樣品, 應(yīng) 更換一個(gè)加樣頭,以防污染,加樣時(shí)勿碰壞樣品孔周?chē)哪z面。 (注意:加樣前要先記下 加樣的順

51、序 。4. 電泳:加樣后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳,電壓 60-100V ,樣品由負(fù)極(黑色向正極 (紅色方向移動(dòng)。 電壓升高, 瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低。 當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到距離膠板 下沿約 1cm 處時(shí),停止電泳。(5電泳完畢后,取出凝膠,用含有 0.5 ug/ml的溴化乙錠 1×TAE 溶液染色約 20 min ,再 用清水漂洗 10 min。(6觀察照相:在紫外燈下觀察, DNA 存在則顯示出紅色熒光條帶,采用凝膠成像系統(tǒng)拍照 保存。四、常見(jiàn)問(wèn)題及注意事項(xiàng)1.配瓊脂糖時(shí)應(yīng)使其完全熔化后方可制膠。2.瓊脂糖凝膠易于破碎,操作時(shí)要輕緩。3.電泳時(shí)應(yīng)注意電源線路,預(yù)防觸電。4.溴化乙

52、淀具有致癌作用,配制及使用時(shí)應(yīng)帶乳膠或一次性塑料手套。并在專(zhuān)門(mén)的實(shí)驗(yàn)室 內(nèi)使用。5.紫外線對(duì)人體有損傷作用,開(kāi)燈時(shí)間不宜太長(zhǎng),注意防護(hù)。6. DNA 帶形狀模糊:DNA 加樣過(guò)多;電壓太高;凝膠中有氣泡。7.質(zhì)粒 DNA 的存在形式有 3種,共價(jià)閉環(huán) DNA (cccDNA ,常以超螺旋形式存在; 開(kāi)環(huán) DNA (ocDNA ,此種質(zhì)粒 DNA 的兩條鏈中有一條發(fā)生一處或多處斷裂,因此可以自 由旋轉(zhuǎn)從而消除張力,形成松弛的環(huán)狀分子;線狀 DNA ,因質(zhì)粒 DNA 的兩條鏈在同一 處斷裂而造成。因此質(zhì)粒 DNA 電泳的結(jié)果中有可能出現(xiàn)三條泳帶,它們的泳動(dòng)速度為: cccDNA > 線狀 D

53、NA > ocDNA。實(shí)驗(yàn)四 限制性內(nèi)切核酸酶的酶切與鑒定一、實(shí)驗(yàn)原理限制性內(nèi)切酶是一類(lèi)能識(shí)別雙鏈 DNA 分子中特異核苷酸序列的 DNA 水解酶, 主 要存在于原核生物中。 根據(jù)限制酶的識(shí)別切割特性、 催化條件及是否具有修飾酶活性可分為 、型三大類(lèi)。 其中類(lèi)酶在分子克隆和基因操作中最為有用,是常用的分子生物學(xué) 工具酶。限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列長(zhǎng)度一般為 48個(gè)呈回文序列的特異核苷酸對(duì)。一般情況下,識(shí)別 序列越長(zhǎng),在同一 DNA 分子中識(shí)別位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率就越小。許多限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn) 已被確定。例如 EcoRl 酶的識(shí)別與切割序列為以下 6個(gè)堿基對(duì)。5 GAATTC 33 CTT AAG

54、 5EcoR I以獨(dú)特的方式識(shí)別并裂解這個(gè)順序,形成兩個(gè) 5突出末端:和G AATTCCTT AA G這些末端為互補(bǔ)的,即粘性末端,并可在連接酶的催化下與由 EcoR I 產(chǎn)生的其它分子末端 相連接。限制性內(nèi)切酶主要用于基因組 DNA 的片段化、重組 DNA 分子的構(gòu)建與鑒定、載體中目的 基因片段的分離與回收以及 DNA 分子物理圖譜的構(gòu)建等。根據(jù)酶切目的和要求不同,可有 單酶切、 雙酶切或部分酶切等不同方式。 根據(jù)酶切反應(yīng)的體積不同, 可分為小量酶切反應(yīng)和 大量的酶切反應(yīng)。小量酶切反應(yīng)主要應(yīng)用于質(zhì)粒的酶切鑒定, 體積為 20 l, 含 0.21 g DNA ,大量酶切反應(yīng)用于制備目的基因片段

55、,體積為 50100 l , DNA 用量在 1030ug 。本實(shí)驗(yàn)為 EcoR I 對(duì)質(zhì)粒 pUC18的小量酶切。 在質(zhì)粒的雙鏈環(huán)狀 DNA 分子上有多個(gè)限制 性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。 在用特定的限制性內(nèi)切核酸酶對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切反應(yīng)后, 通?？刹捎?瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定酶切效果。二、儀器與試劑1. 儀器:水浴鍋、離心管、移液器、吸頭、 電泳設(shè)備等。2. 試劑:質(zhì)粒 pUC18、 EcoR I限制性內(nèi)切核酸酶、內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液、瓊脂糖、電泳緩沖液、 6×上 樣緩沖液、溴化乙啶染液、無(wú)菌水等。三、操作步驟1.限制性內(nèi)切酶反應(yīng)一般在滅菌的 0.2或 0.5ml PCR薄壁離心管中進(jìn)行。2.

56、 酶切反應(yīng)體系(10ul :酶解緩沖液(10×buffer 1 ul限制性內(nèi)切酶 0.5 ul EcoR I(7.5U底物 DNA (質(zhì)粒 x ul(依質(zhì)粒濃度而定滅菌 ddH2O 加至 10 ul限制性內(nèi)切酶最后加入,手彈混勻或用吸頭輕輕上下吹吸,混勻后 6000 r/min, 離心 15s 。 37水浴消化 2h 。3. 酶切完畢, 取 5ul 酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳, 鑒定酶切反應(yīng)效果, 必須用 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)物同時(shí)進(jìn)行電泳以確定 DNA 片段的大小。 如果酶切不完全, 可繼續(xù) . 酶解消化反 應(yīng),或加入適量酶后繼續(xù)反應(yīng)。5. 經(jīng)電泳觀察酶切反應(yīng)完全后,將上述反應(yīng)液置

57、65水浴中 1015min ,中止酶切反應(yīng), 將剩余酶切產(chǎn)物保存于 ?C20備用。四、注意事項(xiàng)1. 限制性內(nèi)切酶需保存于 -20,操作時(shí)應(yīng)將酶保持在冰浴中,避免長(zhǎng)時(shí)間置于高溫中。2. 限制性內(nèi)切酶溶液通常含有 50%甘油,加入反應(yīng)管后,因密度較大,往往沉淀至 溶液底部,所以要充分搖勻。3. 加樣時(shí)吸頭垂直進(jìn)入試劑管,避免碰到管壁,每加完一樣要換一個(gè)吸頭,同時(shí)在 已加的樣品前做個(gè)記號(hào)以防止錯(cuò)加或漏加,避免污染。4. 酶(置于冰盒上應(yīng)最后加入,盡量減少室溫接觸機(jī)會(huì)。加酶時(shí)吸頭深入不可過(guò) 深。5. 酶解消化反應(yīng)溫度及時(shí)間根據(jù)該酶使用說(shuō)明書(shū)而定。6. 注意酶的用量,加入的酶量按 1-3U/ug DNA

58、計(jì)算,酶的體積應(yīng)低于反應(yīng)總體積的 10%,以避免酶液中甘油干擾反應(yīng) 。酶量過(guò)大( 25U/ug DNA時(shí),有產(chǎn)生所謂星號(hào) 活性的可能,即在識(shí)別序列以外的位點(diǎn)進(jìn)行切割。此外,反應(yīng)體系中甘油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于 12%,以及缺少 NACL 和存在 M 等情況下,都有可能出現(xiàn)星號(hào)活性。五、相關(guān)問(wèn)題1. 酶的保存不同的限制酶往往保存在大致相似的緩沖液中,這種特定配方的緩沖液能使酶活 性維持較長(zhǎng)時(shí)間。常用的保存緩沖液各組分作用如下:Tris-HCl (7.4 7.8 :維持穩(wěn)定的 pH 范圍。50-100mmol/L NaCl 或 KCl :提供一定的離子強(qiáng)度。0.1mmol/L EDTA :絡(luò)合掉能激活限制酶的鎂離子。 1mmol/L DTT :保護(hù)酶分子上的還原性基團(tuán)。200-500ug/ml BSA:牛血清白