基于多次注射鏈脲佐菌素的1dm小鼠糖尿病模型的制備

基于多次注射鏈脲佐菌素的1dm小鼠糖尿病模型的制備

糖尿病是由遺傳因素和環(huán)境因素引起的一種復(fù)雜疾病。由于糖尿病的病因和發(fā)病機制尚不清楚，因此缺乏控制糖尿病發(fā)病率的有效措施。糖尿病的發(fā)病率隨著人們生活條件的改善而不斷增加。在糖尿病研究領(lǐng)域優(yōu)化糖尿病實驗動物模型的研究,尋找更接近人類糖尿病自然發(fā)病過程的動物模型,對于深入研究糖尿病病因及發(fā)病機理,闡明糖尿病及其合并癥發(fā)生發(fā)展的細胞分子生物學(xué)機制具有重要的科學(xué)意義。在1型糖尿病實驗動物模型研究領(lǐng)域,傳統(tǒng)上應(yīng)用一次大劑量胰島β細胞毒化學(xué)藥物(鏈脲佐菌素或四氧嘧啶等)注射造模,由于大量胰島β細胞短時間驟然破壞,模型鼠往往死于化學(xué)藥物注射后的高胰島素血癥與繼之發(fā)生的重度糖尿病,較高的模型動物死亡率常常使實驗研究進入困境。隨著人類基因組計劃的實施與糖尿病病因與發(fā)病機理研究的不斷深入,不僅提出了胰島β細胞受損的自身免疫機理、氧化侵襲機理、細胞凋亡機理、遺傳學(xué)分子機理,而且證實了胰島β細胞破壞引起糖尿病發(fā)作是一個漸進發(fā)生、累積加重的過程,相應(yīng)地糖尿病實驗動物模型由小劑量多次注射鏈脲佐菌素(multiplelowdoseofstreptozotocin,MLDS)鼠模型代替了一次大劑量注射化學(xué)藥物實驗鼠模型。盡管MLDS糖尿病動物模型問世以來為糖尿病病因與發(fā)病機理的細胞分子機理研究奠定了重要科學(xué)基礎(chǔ),但在動物模型制備的化學(xué)藥物種類、注射劑量、注射時間等條件選擇上存在較多問題。本研究通過對MLDS方法誘導(dǎo)的T1DM模型優(yōu)化研究,為T1DM模型制備提供進一步的最佳化條件,使糖尿病病因與發(fā)病機理的研究建立在更科學(xué)化的實驗動物模型基礎(chǔ)之上。1材料和方法1.1對于小劑量的重復(fù)，多酚托諾菌素mlsd可誘導(dǎo)雌性csi模式下的南宋鼠模型1.1.1實驗動物健康純系雌性C57BL小鼠22只,體重16±2g,由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。1.1.2stz分次注射治療22只雌性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周之后隨機分為3組:(1)STZ小劑量組(7只,52mg/kg.BW);(2)STZ大劑量組(7只,72mg/kg.BW);(3)正常對照組(8只)。應(yīng)用0.1MpH4.4枸櫞酸鹽緩沖液配制0.6%STZ溶液,各組按相應(yīng)劑量腹腔注射,每日1次,連續(xù)5日。正常組注射同體積的0.1MpH4.4枸櫞酸鹽緩沖液。模型判別標(biāo)準:注射STZ第19天小鼠血糖大于等于12mmol/L、持續(xù)2周可作為T1DM動物模型。1.1.3體重測定情況(1)一般狀態(tài):觀察小鼠飲水進食及活動情況,每周測一次體重。(2)使用末梢全血血糖測試儀(怡成公司),每周測一次血糖濃度。(3)糖尿病模型成功率與死亡率。1.2mld誘導(dǎo)雄性大鼠t1sd模型的研究1.2.1實驗動物健康純系雄性C57BL小鼠40只,體重22±2g,由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供。1.2.2糖尿病模型制備方法40只雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周之后隨機分為2組:(1)T1DM組(20只);(2)正常組(20只)。模型制備方法同前,以75mg/kg.BW劑量給T1DM組小鼠腹腔注射。糖尿病模型判別標(biāo)準同1.12;觀察指標(biāo)同1.13。1.3mld誘導(dǎo)雄性cs7bl大鼠t1dm模型的再研究1.3.1實驗動物健康純系雄性C57BL小鼠26只,體重18±2g,由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供。1.3.2小鼠模型制備方法將26只雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周之后隨機分為T1DM組(13只);正常組(13只),模型制備方法同前,以65mg/kg.BW劑量給T1DM組小鼠腹腔注射。糖尿病模型判別標(biāo)準與觀察指標(biāo)分別同1.12與1.13。2結(jié)果2.1mld誘導(dǎo)雌性瓊氏育種cs7bl大鼠t1sd模型2.1.1stz分次注射糖尿病模型STZ小劑量組和STZ大劑量組小鼠于注射0.6%STZ一周后飲水量明顯增加,約為造模前的2-3倍,進食量也明顯增加,活動減少,以STZ大劑量組為重。在整個實驗期間正常組小鼠體重有穩(wěn)步增長;STZ小劑量組小鼠體重在注射1周后短暫下降之后增長緩慢;STZ大劑量組小鼠體重也在1周下降,下降幅度大于STZ小劑量組,詳見圖1(W0周為注射STZ第1天)。2.1.2正常組和正常組不同時間點兩組的比較注射STZ第33天,STZ小劑量組小鼠血糖水平高于正常組,但無顯著差異;STZ大劑量組小鼠血糖水平明顯升高(自身前后對比P<0.01),并明顯高于STZ小劑量組和正常組,P<0.01,詳見圖2。2.1.31rm組大鼠模型的成功率和死亡率注射STZ第33天STZ小劑量組模型成功率為0,死亡率為22.06%。STZ大劑量組模型成功率為57.14%,死亡率為28.56%。2.2mld誘導(dǎo)s1dm模式為雄性大鼠2.2.1各組大鼠體重、水量、尿量變化對比注射STZ第8天開始,T1DM組小鼠飲水量及尿量明顯增加,活動減少,體重下降明顯(自身前后對比P<0.01),體重明顯低于正常組(P<0.01),詳見圖3。2.2.2大鼠血樣結(jié)果T1DM組小鼠注射STZ前后血糖變化極顯著(P<0.01),注射STZ后第33天血糖明顯高于正常組(P<0.01),見圖4。2.2.31rm組大鼠模型的成功率和死亡率造模20只小鼠,注射STZ第33天T1DM組小鼠模型成功率為75%,死亡率為20%。2.3mld模式是雄性cs7bl大鼠161d模型的結(jié)果2.3.1小鼠體重、比及量注射STZ第8天開始T1DM小鼠飲水量及尿量明顯增加,活動減少,小鼠體重明顯下降(自身前后對比P<0.05),并且明顯低于正常組,P<0.05,詳見圖5。2.3.2大鼠血樣結(jié)果T1DM組小鼠注射STZ后第33天,血糖明顯升高(自身前后對比P<0.01),并且高于正常組(P<0.01)。見圖6。2.3.31rm組大鼠模型的成功率和死亡率本實驗共造模13只,注射STZ第33天T1DM組小鼠模型成功率為84.6%,死亡率為0。3糖尿病大鼠模型化學(xué)藥物誘導(dǎo)的糖尿病鼠模型,應(yīng)用時間較長的是一次性大劑量注射β細胞毒藥物(鏈脲佐菌素或四氧嘧啶),短時間內(nèi)大量胰島β細胞破壞往往使動物死于β細胞迅即破壞、釋放胰島素所致的嚴重低血糖和隨之產(chǎn)生的胰島素分泌減低所致的嚴重高血糖反應(yīng)。近年來糖尿病的分子病因?qū)W及發(fā)病機理研究取得了長足的進展,提出了T1DM發(fā)病是由遺傳因素與環(huán)境因素聯(lián)合致病的復(fù)雜病。β細胞破壞是由胰島自身免疫漸進性損害發(fā)生發(fā)展的結(jié)果。從β細胞代謝偏移到糖尿病發(fā)作,經(jīng)過較長時間的潛臨床狀態(tài)。因此,出現(xiàn)了與人類T1DM發(fā)病機理相適應(yīng)的動物模型,即應(yīng)用小劑量多次注射STZ方法(multiplelowdoseofstreptozotocin,MLDS)誘導(dǎo)的糖尿病鼠動物模型。與一次大劑量注射化學(xué)藥物模型相比,MLDS方法造成小批量、持續(xù)性、多次胰島β細胞損害,這種漸進性胰島損害與人類T1DM發(fā)病機制及胰島損害時相類似,不失為一種較先進的T1DM動物模型。STZ是經(jīng)典的致糖尿病藥物,具有活潑的烴基結(jié)構(gòu),可以直接損傷胰島β細胞DNA,刺激其釋放H2O2。過量的H2O2及其轉(zhuǎn)化形成的羥自由基引起細胞DNA斷裂,增加脂質(zhì)過氧化物水平,抑制胰島素釋放。此外STZ存在亞硝基基團,可產(chǎn)生胰島β細胞毒物質(zhì)-NO。NO參與許多自由基級聯(lián)式反應(yīng),誘導(dǎo)胰島β細胞凋亡;還能抑制線粒體功能,降低β細胞代謝和胰島素分泌。STZ由于對實驗動物的胰島β細胞具有高度選擇性的毒性作用,被較多地用于誘導(dǎo)實驗性糖尿病動物模型。C57BL小鼠是近交系小鼠,因其實驗結(jié)果精度高、可比性好、應(yīng)激反應(yīng)均一等優(yōu)點受到較多的應(yīng)用。本實驗采用MLDS方法,應(yīng)用雌性和雄性C57BL小鼠誘導(dǎo)了自身免疫性小鼠T1DM模型。為了提高T1DM鼠模型制備的科學(xué)性,本實驗分別使用C57BL雌性小鼠和雄性小鼠進行3個批次模型優(yōu)化研究。第一次實驗選用C57BL雌性小鼠,以兩種不同劑量(52mg/kg.BW和72mg/kg.BW)STZ制備T1DM模型,實驗結(jié)果表明,大劑量組模型成功率明顯高于小劑量組,但尚未達到理想的水平。第二次實驗選用C57BL雄性小鼠,以75mg/kg.BW劑量制備模型,模型成功率高于第一次實驗的大劑量組,但死亡率較高。第三次實驗