栽培番茄mi-1基因研究進(jìn)展

栽培番茄mi-1基因研究進(jìn)展

根結(jié)線蟲（meloidold.）是一種嚴(yán)重的疾病，主要發(fā)生在熱帶和溫帶地區(qū)。其寄主范圍非常廣泛,超過5500種作物,其中包括單子葉植物、雙子葉植物、草本植物和木本植物。植物被根結(jié)線蟲侵染后,在根系產(chǎn)生巨細(xì)胞和根結(jié),根結(jié)線蟲從中汲取養(yǎng)分,完成生活史。植物感染根結(jié)線蟲易導(dǎo)致減產(chǎn),植株萎蔫,并很容易被其他土傳性病害侵染。通過農(nóng)業(yè)操作、物理防治、化學(xué)防治、生物防治等手段雖然可以在一定程度上緩解根結(jié)線蟲對(duì)作物造成的危害,但是不能從根本上解決根結(jié)線蟲的危害,甚至?xí)?duì)環(huán)境造成破壞,而選育抗病品種是一種經(jīng)濟(jì)、有效、環(huán)保的防治途徑。番茄(Solanumlycopersicum)作為一種重要的蔬菜作物,也是根結(jié)線蟲的重要寄主之一,但是通過選育具有抗病基因的番茄材料,可以在很大程度上緩解根結(jié)線蟲對(duì)番茄造成的危害。目前已知的番茄中根結(jié)線蟲病抗性基因共有9個(gè),分別為Mi-1、Mi-2……Mi-9,對(duì)這些抗病基因進(jìn)行研究,可以加快抗病新品種的選育。1抗根結(jié)線昆蟲疾病基因mi-11.1mi-1基因?qū)Ψ芽垢Y(jié)線蟲病的抗性番茄對(duì)根結(jié)線蟲病的抗性最早是在秘魯番茄(S.peruvianum)PI128657中發(fā)現(xiàn)的,該番茄種與栽培番茄很難雜交。20世紀(jì)40年代,Smith通過胚挽救的方法,實(shí)現(xiàn)了PI128657與栽培番茄的雜交,唯一的一株雜交F1單株成為了目前鮮食番茄和加工番茄抗根結(jié)線蟲病材料的來源。通過遺傳分析,確定PI128657中的根結(jié)線蟲病抗性基因?yàn)閱位蝻@性遺傳控制,將其命名為Mi基因,也就是現(xiàn)在所說的Mi-1基因。該基因除了具有對(duì)根結(jié)線蟲病的抗性以外,對(duì)馬鈴薯長管蚜蟲(Macrosiphumeuphorbiae)和白粉虱(Bemisiatabaci)造成的病害均具有抗性。此外,番茄白粉病的抗病基因很可能也是Mi-1基因,或者是該基因的同源基因。通過分子標(biāo)記篩選,獲得了與抗病基因連鎖的分子標(biāo)記,將Mi-1基因定位到了番茄6號(hào)染色體的短臂端。在同工酶標(biāo)記Aps-1和DNA標(biāo)記Rex-1等的幫助下,Mi-1基因被用于很多的栽培番茄材料中。在含有Mi-1基因的番茄材料中,根結(jié)線蟲不能使植物產(chǎn)生巨型細(xì)胞,而是在線蟲所侵染的區(qū)域發(fā)生過敏性反應(yīng),抑制線蟲取食。1.2mi-1基因序列的擴(kuò)增Mi-1基因的克隆是通過圖位克隆的方法實(shí)現(xiàn)的。Mi-1基因的精細(xì)定位是一個(gè)艱苦的過程,因?yàn)樵贛i-1基因的位點(diǎn)處會(huì)發(fā)生重組抑制現(xiàn)象,很難找到距Mi-1基因較近的連鎖的分子標(biāo)記。近年來,Mi-1基因所處的區(qū)域內(nèi)的重組抑制現(xiàn)象的原因得到了進(jìn)一步研究。通過對(duì)抗感病栽培番茄材料該區(qū)域的BAC文庫分析,確定在這個(gè)區(qū)域內(nèi),抗感病材料間存在染色體區(qū)段的倒置現(xiàn)象。之后對(duì)這一區(qū)段進(jìn)行熒光原位雜交的分析,同樣發(fā)現(xiàn)染色體區(qū)段的倒置,這就很好地解釋了Mi-1基因位點(diǎn)處重組抑制的現(xiàn)象。之后通過含有21089株F2單株的群體,將Mi-1定位在550kb間隔的區(qū)域內(nèi)。為了進(jìn)一步克服重組抑制的影響,利用秘魯番茄材料PI128657和LA2964構(gòu)建了假F2群體(pseudo-F2population,因?yàn)閮捎H本所構(gòu)建的F1單株自交不親和,所以將不同的F1單株進(jìn)行雜交,獲得的后代群體與F2群體的分離比例相同,但是因?yàn)椴⒎鞘怯蒄1單株自交所獲得的F2群體,因此將這一群體稱為假F2群體),將Mi-1定位在標(biāo)記C32.1與C93.1之間,對(duì)比這兩個(gè)標(biāo)記在栽培番茄VFNT中的信息,將Mi-1基因確定在65kb間隔的區(qū)域內(nèi)。對(duì)該區(qū)域內(nèi)的BAC進(jìn)行序列分析,獲得了2個(gè)候選基因Mi-1.1和Mi-1.2,它們具有95%的序列同源性,通過轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)性試驗(yàn),確定Mi-1.2為根結(jié)線蟲病的抗性基因,即Mi-1基因。該基因編碼1257個(gè)氨基酸,具有亮氨酸拉鏈、核苷酸結(jié)合位點(diǎn)和富亮氨酸重復(fù)區(qū)域,是具有這些結(jié)構(gòu)的抗病基因家族的一員。1.3mi-1在不同發(fā)育時(shí)期的生長很多抗病基因都是組成型基因,在植物中無所不在。利用Mi-1基因的特異引物對(duì)抗根結(jié)線蟲的番茄材料在不同時(shí)期、不同器官中Mi-1基因的表達(dá)狀況進(jìn)行了RT-PCR分析。結(jié)果顯示,在抗病材料Motelle的種子、根系、莖、葉、花和果實(shí)中均可以檢測到Mi-1基因的表達(dá),而在感病材料Moneymaker所有器官中均檢測不到Mi-1基因的表達(dá)。Mi-1基因的表達(dá)在葉片和根系不同發(fā)育時(shí)期,以及接種前后都不會(huì)發(fā)生明顯的變化。在抗根結(jié)線蟲病的番茄發(fā)芽后24h接種根結(jié)線蟲,發(fā)現(xiàn)其具有抗病性。而Mi-1基因?qū)ρ料x的抗性受到發(fā)育的調(diào)控,植株發(fā)芽5周以后,才具有對(duì)蚜蟲的抗性,對(duì)白粉虱的抗病性同樣受到了發(fā)育的調(diào)控。同一個(gè)基因,在表達(dá)狀況相似時(shí),表現(xiàn)出對(duì)不同病原物的抗性,可能與其轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控有關(guān),這方面的研究還在進(jìn)行中。1.4mi-1基因?qū)ΩY(jié)線蟲的抗性Mi-1基因是栽培番茄中唯一存在的根結(jié)線蟲病的抗性基因,也是番茄中所有9個(gè)已知抗病基因中唯一被克隆的基因。在過去60多年中,該基因在抗根結(jié)線蟲病中,發(fā)揮了巨大作用。但其應(yīng)用也受到了日益嚴(yán)重的挑戰(zhàn),主要來自兩個(gè)方面:一方面,具有Mi-1基因的番茄材料在土壤溫度高于28℃時(shí)就喪失了對(duì)根結(jié)線蟲病的抗性,這在夏季炎熱地區(qū)和保護(hù)地栽培中是非常不利的;另一方面,單一抗原對(duì)根結(jié)線蟲的選擇,使得根結(jié)線蟲進(jìn)化,產(chǎn)生了可以突破Mi-1基因抗性的線蟲群體,對(duì)本來具有抗性的番茄材料產(chǎn)生致病性。因?yàn)檫@兩方面的挑戰(zhàn),選育具有優(yōu)良抗病基因的栽培番茄,就顯得十分重要了。2mi-9基因的抗性為了彌補(bǔ)Mi-1基因在生產(chǎn)中的不足,需要對(duì)其他存在于野生番茄中的根結(jié)線蟲病抗性基因加以研究和利用。在這些基因中,有一些基因具有熱穩(wěn)定的根結(jié)線蟲抗性,在土壤溫度達(dá)到32℃時(shí)仍然保持良好的抗病性;有一些基因具有對(duì)突破Mi-1抗性的線蟲群體具有抗病性。對(duì)這些基因的研究將會(huì)是番茄根結(jié)線蟲病抗性育種的一個(gè)重要策略。目前研究較多的基因主要是Mi-3基因和Mi-9基因。材料PI126443-1MH(S.peruvianum)中的Mi-3基因?qū)ΩY(jié)線蟲557R(Mi-1基因?qū)λ鼰o抗性)具有抗性,并且在土壤溫度達(dá)到32℃時(shí)仍然保持對(duì)根結(jié)線蟲的抗性,該基因被定位在番茄第12號(hào)染色體的短臂端,位于標(biāo)記P22L與E21L之間的0.25cM間隔區(qū)域內(nèi),標(biāo)記N22R與Mi-3基因共分離,可以用于標(biāo)記輔助選擇育種。材料LA2157(S.arcanum)中具有對(duì)根結(jié)線蟲病的單顯性抗性基因Mi-9,與Mi-1有很多的相似點(diǎn)。兩個(gè)基因均對(duì)南方根結(jié)線蟲(M.incognita)、爪哇根結(jié)線蟲(M.javanica)、花生根結(jié)線蟲(M.arenaria)具有抗性;這2個(gè)基因均定位于番茄6號(hào)染色體短臂端的同一區(qū)域內(nèi);標(biāo)記REX-1和C8B在定位這兩個(gè)基因的群體內(nèi)均具有連鎖遺傳關(guān)系。但是Mi-9基因在土壤溫度達(dá)到32℃時(shí)仍然具有熱穩(wěn)定的根結(jié)線蟲病抗性。通過病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù),利用Mi-1基因序列成功地將LA2157中Mi-9的抗性沉默,證實(shí)Mi-9基因與Mi-1基因具有同源性。相對(duì)于Mi-3和Mi-9基因,其他野生番茄中根結(jié)線蟲病的抗性基因研究相對(duì)較少,大多只是進(jìn)行了抗譜鑒定和遺傳分析(表1)。3mi-1基因檢測在Mi-1基因克隆后,位于基因內(nèi)的PCR標(biāo)記被開發(fā),徹底避免了在標(biāo)記輔助選擇中因?yàn)闃?biāo)記和基因分離所造成的誤選。Mi-1基因除了為栽培番茄提供根結(jié)線蟲的抗性外,還可以賦予那些受根結(jié)線蟲危害嚴(yán)重,而又不具有抗原基因的作物以抗性。Mi-1基因通過農(nóng)桿菌侵染,轉(zhuǎn)化到萵苣中,在轉(zhuǎn)基因植株中檢測到了Mi-1基因的表達(dá),轉(zhuǎn)基因萵苣對(duì)根結(jié)線蟲病的抗性得以提升。Mi-1基因從野生番茄導(dǎo)入栽培番茄是通過胚挽救的方法實(shí)現(xiàn)的,利用這種方法,同樣可以嘗試將其他根結(jié)線蟲病抗性基因?qū)氲皆耘喾阎?。如將含有Mi-3基因的野生番茄材料與栽培番茄雜交,通過分子檢測的手段,證實(shí)獲得了雜交F1植株,但尚缺乏應(yīng)用方面的報(bào)道。4mi-1與根結(jié)線蟲抗性抗病基因在抵御病原物方面發(fā)揮了巨大作用,而植物的抗病性是一個(gè)復(fù)雜的反應(yīng)。植物免疫需要識(shí)別病原物入侵的檢測系統(tǒng)。植株在發(fā)揮其抗病性時(shí),其中的一些作用因子可以與抗病蛋白質(zhì)發(fā)生互作,是抗病功能所需要的。通過突變體的誘導(dǎo)和篩選,獲得了根結(jié)線蟲病和蚜蟲病抗性喪失的突變體Rme1,并確定該突變體只對(duì)這兩種病害失去抗性。對(duì)該突變體進(jìn)一步研究證實(shí),Mi-1基因在對(duì)根結(jié)線蟲、蚜蟲和白粉虱發(fā)揮抗性時(shí)需要Rme1基因。此外對(duì)攜帶Mi-1基因并轉(zhuǎn)化有水楊酸羥化酶基因NahG的植株進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)水楊酸是誘導(dǎo)植株產(chǎn)生根結(jié)線蟲抗性的一個(gè)重要的信號(hào)原件。病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)是通過構(gòu)建病毒載體,將目的基因沉默,可以用來研究某一基因或該基因家族的功能。利用該技術(shù)不僅在研究番茄根結(jié)線蟲病抗性基因間的關(guān)系時(shí)發(fā)揮了很大作用,在研究與抗病基因Mi-1相關(guān)的基因功能時(shí),同樣發(fā)揮了重要作用。分裂素活化蛋白激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)與Mi-1基因?qū)ρ料x的抗性有關(guān)系。對(duì)熱激蛋白Hsp90-1基因和與其互作的Sgt1-1基因進(jìn)行基因沉默都可以使植株對(duì)根結(jié)線蟲和蚜蟲的抗性能力下降。WRKY72轉(zhuǎn)錄因子與Mi-1誘導(dǎo)的根結(jié)線蟲抗性有關(guān),又因?yàn)閃RKY72的作用基因?qū)λ畻钏釠]有響應(yīng),因此認(rèn)為WRKY72轉(zhuǎn)錄因子所發(fā)揮的抗性,是通過獨(dú)立于水楊酸防御機(jī)制的另一種途徑實(shí)現(xiàn)的。SlSERK1的沉默證明其在蚜蟲的抗性方面發(fā)揮著作用,但是在對(duì)根結(jié)線蟲的抗性方面沒有影響。這些相關(guān)基因的不斷研究,可以用來解釋Mi-1基因?qū)ρ料x和根結(jié)線蟲發(fā)揮抗性的機(jī)理。5抗根結(jié)線蟲基因的研究隨著生物技術(shù)的發(fā)展、生物信息學(xué)的進(jìn)步和新的抗病材料的發(fā)現(xiàn),番茄中根結(jié)線蟲病抗性基因在育種中的應(yīng)用前景是廣闊的。野生番茄中優(yōu)良的抗根結(jié)線蟲基因的定位,可以用于標(biāo)記輔助育種,加快優(yōu)良基因向栽培番茄的選育?？共』虻目寺?可以為尚未克隆相關(guān)基因的其他作物提供研究基礎(chǔ),加快抗病基因的