2型糖尿病大鼠模型的改良

2型糖尿病大鼠模型的改良

高脂肪飲食與低劑量糖結(jié)合是創(chuàng)造2型糖尿病動(dòng)物模型的常用方法。該模型方法具有方法簡(jiǎn)單、成本低、模型穩(wěn)定、適合人類2型糖尿病的臨床特征等優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)有研究報(bào)告多選用成年大鼠建模,由于建模需時(shí)較長(zhǎng),模型大鼠容易進(jìn)入老年期,生存質(zhì)量下降沒(méi)有充分的時(shí)間保證糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。本研究在參考前人的研究基礎(chǔ)上,利用SD幼鼠建立2型糖尿病及其并發(fā)癥模型,并摸索了STZ的用量和取血方式等,對(duì)建模方法進(jìn)行了改良。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)大鼠空腹血糖情況健康清潔級(jí)4周齡SD雄性幼鼠40只,由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供[SCXK(黔)2002-0001]。測(cè)定每只大鼠的空腹血糖,血糖正常者進(jìn)入實(shí)驗(yàn),隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,每組20只。每籠為同組的大鼠5只,自由攝食飲水,自然光照。1.2血糖中試、飼料STZ(美國(guó)Sigma公司),胰島素測(cè)定試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所),血糖儀、血糖試紙(美國(guó)雅培公司),甘油三酯、膽固醇、ALT、AST檢測(cè)試劑盒(四川邁克公司)等。普通飼料:碳水化合物60%、蛋白質(zhì)22%、脂肪10%、其他8%。高脂高糖飼料:動(dòng)物脂肪15%、蔗糖20%、膽固醇5%、普通飼料60%,飼料由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心加工。1.3胰島素抵抗試驗(yàn)對(duì)照組喂以普通飼料,實(shí)驗(yàn)組喂以高脂高糖飼料,每15天監(jiān)測(cè)一次體重,4個(gè)月后尾動(dòng)脈取血,檢測(cè)空腹血糖、空腹胰島素、甘油三酯和膽固醇,以胰島素作用指數(shù)(Insulinactionindex,IAI)評(píng)價(jià)其胰島素抵抗程度,IAI=ln[1/(空腹胰島素×空腹血糖)],IAI<對(duì)照組即為誘導(dǎo)胰島素抵抗成功。1.4不同劑量stz的血清注射另外選取成年健康SD雄性大鼠25只,適應(yīng)環(huán)境1周。將25只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、D20、D30、D40、D50組,禁食12h后,對(duì)照組腹腔注射枸櫞酸緩沖液,D20、D30、D40、D50組分別按20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg的劑量腹腔注射STZ溶液,72h后尾部取血測(cè)定空腹血糖。選擇能使血糖升高但低于糖尿病標(biāo)準(zhǔn)(本研究確定為介于4.61mmol/L~7.1mmol/L之間)的劑量為STZ亞致病劑量。1.52配成10g/l枸杞酸緩沖液胰島素抵抗誘導(dǎo)成功后,實(shí)驗(yàn)組大鼠空腹腹腔注射亞致病劑量的STZ(以pH4.4,0.01mmol/L枸櫞酸緩沖液配成20g/L濃度),對(duì)照組僅注射相同體積枸櫞酸緩沖液。注射STZ72h后,空腹血糖>7.0mmol/L、隔天隨機(jī)血糖>11.1mmol/L者即為2型糖尿病大鼠模型。每周通過(guò)尿試紙檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組尿糖,間接觀察其血糖的變化趨勢(shì)。1.62大鼠糖尿病并發(fā)癥的檢測(cè)繼續(xù)高脂高糖飲食喂養(yǎng)2型糖尿病大鼠使病程發(fā)展,逐月分批眼球摘除放血處死大鼠,檢測(cè)其生化指標(biāo)并結(jié)合臟器的病理變化來(lái)評(píng)價(jià)糖尿病并發(fā)癥的發(fā)展。1.7處理數(shù)據(jù)計(jì)量資料數(shù)據(jù)均以表示,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組生化結(jié)果比較用t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)處理及制圖采用Excel軟件完成。2結(jié)果2.1大鼠胰島素抵抗試驗(yàn)與對(duì)照組大鼠比較,高脂高糖組大鼠經(jīng)喂養(yǎng)4個(gè)月后,體重明顯增加,血糖升高,血清胰島素水平升高,實(shí)驗(yàn)組IAI<對(duì)照組,血脂紊亂(表1),以上指標(biāo)說(shuō)明高脂高糖飲食誘導(dǎo)大鼠胰島素抵抗成功。2.2stz亞致病劑量的確定腹腔注射STZ后,D20、D30、D40、D50各組大鼠空腹血糖均有不同程度的升高(圖1),其中30mg/kg大鼠體重的劑量能導(dǎo)致空腹血糖升高(6.27±0.17mmol/L),但低于致糖尿病的標(biāo)準(zhǔn)(7.0mmol/L),確定為STZ亞致病劑量。2.32糖尿病大鼠模型建立的實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)組20只大鼠在高脂高糖喂養(yǎng)過(guò)程中,體重增長(zhǎng)速度快于對(duì)照組,4個(gè)月后100%出現(xiàn)胰島素抵抗,注射30mg/kg劑量的STZ后,實(shí)驗(yàn)組20只大鼠血糖明顯升高,其均值為13.7±1.57mmol/L,大鼠出現(xiàn)緩慢的消瘦、飲食大幅增多,24h尿量明顯增多,部分大鼠出現(xiàn)爛尾現(xiàn)象,具有糖尿病典型的“三多一少”臨床表現(xiàn),說(shuō)明2型糖尿病大鼠模型建立成功。成模后,其尿糖水平一直保持在“+++~++++”,說(shuō)明模型穩(wěn)定性較好。2.4型糖尿病及其并發(fā)癥模型的建立和模型評(píng)價(jià)在2型糖尿病大鼠成模3個(gè)月后,大鼠的胰腺、肝臟、腎臟、脾臟和腦組織等多個(gè)器官發(fā)生病變?，F(xiàn)以肝臟為代表進(jìn)行報(bào)道。與正常對(duì)照組比較,2型糖尿病組大鼠肝臟體積增大,出現(xiàn)明顯的脂肪肝病變(圖2)。HE染色顯示肝細(xì)胞明顯空泡變性(圖中箭頭所示)、可見(jiàn)點(diǎn)狀壞死,匯管區(qū)有炎細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3)。(圖見(jiàn)彩插1)胰島素抵抗與胰島功能受損是2型糖尿病的發(fā)病機(jī)理中不可缺少的兩個(gè)重要因素,并且胰島素抵抗是2型糖尿病的始動(dòng)因素,而長(zhǎng)期高脂高糖量飲食喂養(yǎng)能誘導(dǎo)大鼠能產(chǎn)生胰島素抵抗。在此基礎(chǔ)上,我們采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)SD幼鼠形成胰島素抵抗,再給予亞致病劑量的的STZ建立2型糖尿病模型,繼續(xù)高脂高糖喂養(yǎng),使其血糖維持在高水平,形成2型糖尿病并多種并發(fā)癥。通過(guò)對(duì)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠的多個(gè)生化指標(biāo)以及臟器病理變化的觀察,表明本研究成功建立了2型糖尿病及其并發(fā)癥模型。采取幼鼠造模的優(yōu)勢(shì):由于形成胰島素抵抗的時(shí)間需要4個(gè)月,成年大鼠經(jīng)過(guò)4個(gè)月的飼養(yǎng)后,有可能進(jìn)入老齡期,老齡化會(huì)導(dǎo)致胰腺功能減退、空腹血糖、胰島素升高。采用一個(gè)月的幼鼠造模,此時(shí)實(shí)驗(yàn)大鼠年齡為5個(gè)月,處于成年期,成年大鼠對(duì)于STZ造成胰腺損傷修復(fù)功能較強(qiáng),能保持血糖水平不至于太高,延長(zhǎng)了模型大鼠的生存時(shí)間,有充分的時(shí)間保證2型糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。在建模過(guò)程中,經(jīng)高脂高糖飲食喂養(yǎng)4個(gè)月后,大鼠還具有典型的腹部肥胖、血脂紊亂、血壓升高等代謝綜合征的特點(diǎn),可用于代謝綜合征發(fā)病機(jī)制和脂毒性等相關(guān)研究。同時(shí),流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病及其并發(fā)癥在肥胖兒童人群中發(fā)病率呈上升趨勢(shì),采用幼鼠造模符合這一特點(diǎn),能為肥胖兒童糖尿病研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。STZ亞致病劑量的確定:STZ能特異性殺傷胰島β細(xì)胞是誘發(fā)糖尿病的機(jī)制,目前對(duì)于STZ的用量和用法均有不同的觀點(diǎn)。多數(shù)研究都是參考他人報(bào)道劑量,由于大鼠的個(gè)體差異而存在一定的缺陷。本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn),觀察不同劑量STZ對(duì)大鼠血糖的影響,確定了本研究的用量,這是對(duì)該類建模方法的有益補(bǔ)充。在建模方法上,本研究還摸索了大鼠取血方式:對(duì)于少量的用血(1mL以下),如用血糖儀測(cè)血糖時(shí),可用針刺尾靜脈或斷尾取血;自體前后對(duì)照和長(zhǎng)期間斷取血,用血量大(1mL以上),但又不能危害大鼠生命時(shí),如檢測(cè)大鼠血脂、肝功能時(shí),可從尾動(dòng)脈用注射器取血;需大量用血(5~10mL)且不需顧及大鼠生命時(shí),可以摘眼球取血。通過(guò)上述方法采取的血液具有無(wú)污染、不溶血的特點(diǎn),能滿足不同的實(shí)驗(yàn)需要。2型糖尿病大鼠模型的判斷標(biāo)準(zhǔn)有待商榷:目前對(duì)于2型糖尿病模型診斷標(biāo)準(zhǔn)目前尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),主要是空腹血糖結(jié)合胰島素抵抗來(lái)判定。由于造模方法和模型遺傳背景的差異,血糖升高標(biāo)準(zhǔn)也各不相同,從7.8mmol/L~16.8mmol/L均有報(bào)道。由于大鼠采血困難,本研究采用空腹血糖和空腹胰島素來(lái)評(píng)價(jià)2型糖尿病,血糖水平采用的是ADA90制定的人類2型糖尿病的判斷標(biāo)準(zhǔn),略低于報(bào)