2型糖尿病大鼠模型的建立

2型糖尿病大鼠模型的建立

0高脂飲食模型2型糖尿病在中國已成為繼心血管疾病和腫瘤之后的第三殺手。成功建立2型糖尿病動(dòng)物模型是深入研究2型糖尿病及其并發(fā)癥的基礎(chǔ)。在目前國內(nèi)多種造模方式中以高脂飲食加腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素最為常用。一般認(rèn)為該模型具有外周胰島素抵抗和胰島功能輕度受損雙重特點(diǎn),在一定程度上符合人2型糖尿病的病理過程。但事實(shí)上高脂飲食僅能誘發(fā)一部分大鼠發(fā)生胰島素抵抗和肥胖,另一部分則不發(fā)生胰島素抵抗和肥胖。因而本實(shí)驗(yàn)從高脂飲食大鼠中篩選出食源性肥胖大鼠,進(jìn)而腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素,以確保胰島素抵抗的存在及較高的2型糖尿病成模率,從而建立一種更加符合人類2型糖尿病發(fā)病機(jī)制的動(dòng)物模型。1大鼠血糖檢測指標(biāo)設(shè)計(jì):隨機(jī)對照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。時(shí)間及地點(diǎn):于2006-01/2007-05在河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心完成。材料:健康7周齡雄性SD大鼠70只,體質(zhì)量約200g,由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物許可證號:DK0408-0089)。實(shí)驗(yàn)對動(dòng)物的處理方法符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。實(shí)驗(yàn)方法:分組與建模:SD大鼠70只適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)分成對照組20只和高脂飲食組50只。對照組給予常規(guī)飼料。高脂飲食組給予高脂飲食(常規(guī)飼料基礎(chǔ)上加10%豬油,2%膽固醇)4周后,據(jù)體質(zhì)量分2組:體質(zhì)量≥對照組體質(zhì)量均值+2倍標(biāo)準(zhǔn)差者納為食源性肥胖組24只,體質(zhì)量<對照組體質(zhì)量均值+1倍標(biāo)準(zhǔn)差者納為食源性肥胖抵抗組21只;剩余5只淘汰。故實(shí)驗(yàn)共分3組:對照組20只、食源性肥胖組24只及食源性肥胖抵抗組21只。所有大鼠喂養(yǎng)8周后,均腹腔注射鏈脲佐菌素(0.5%鏈脲佐菌素,30mg/kg,0.1mmol/L檸檬酸緩沖液,pH4.4)。10d后,將空腹血糖大于正常大鼠血糖均值+3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差(實(shí)驗(yàn)確定該值為7.8mmol/L),且穩(wěn)定2周以上者,定為2型糖尿病大鼠。血清學(xué)指標(biāo)檢測:每周監(jiān)測大鼠體質(zhì)量;于實(shí)驗(yàn)第8周末采取靜脈血,分離血清,應(yīng)用BeckmanX20全自動(dòng)生化分析儀檢測空腹血糖、總膽固醇、三酰甘油(mmol/L),放射免疫法檢測空腹血清胰島素(mU/L),高胰島素正常葡萄糖鉗夾技術(shù)評價(jià)各組大鼠胰島素抵抗程度,計(jì)算各組大鼠注射鏈脲佐菌素后的2型糖尿病成模率(2型糖尿病大鼠數(shù)量/該組大鼠總數(shù)量×100%)。正常血糖高胰島素鉗夾技術(shù):各組大鼠于實(shí)驗(yàn)第8周末禁食8h,2.5%戊巴比妥鈉腹腔麻醉,分離左頸靜脈和右股動(dòng)脈。自股動(dòng)脈取血1mL,測定血清葡萄糖和胰島素濃度。記錄基礎(chǔ)血糖值。在左頸靜脈以10mg/(kg·min)的速度持續(xù)輸注胰島素,5min后應(yīng)用血糖儀監(jiān)測血糖,如低于基礎(chǔ)血糖值0.5mmol/L,開始輸注20%葡萄糖,輸注速度從6mg/(kg·min)開始,每隔5min測血糖1次,據(jù)所測血糖值調(diào)整葡萄糖輸入速度,使血糖在最短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)到基礎(chǔ)血糖值±0.5mmol/L。當(dāng)血糖值連續(xù)3次均在上述范圍時(shí),視為穩(wěn)定狀態(tài)(一般60min左右可達(dá)穩(wěn)態(tài))。隨后,繼續(xù)上述過程到120min。計(jì)算60~120min的葡萄糖輸入速度,用以評價(jià)受試個(gè)體的胰島素敏感性。主要觀察指標(biāo):大鼠體質(zhì)量、空腹血糖、總膽固醇、三酰甘油、空腹血清胰島素的變化和葡萄糖輸入速度。設(shè)計(jì)、實(shí)施、評估者:實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)施、評估者均為第一作者,均經(jīng)過正規(guī)培訓(xùn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:實(shí)驗(yàn)計(jì)量資料以表示,均符合正態(tài)分布,用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間差異比較采用單因素方差分析。各組大鼠注射鏈脲佐菌素后的2型糖尿病成模率用χ2檢驗(yàn)檢測。P<0.05為差異有顯著性意義。2結(jié)果2.1動(dòng)物的數(shù)量分析實(shí)驗(yàn)大鼠70只,按納入標(biāo)準(zhǔn)納入65只,實(shí)驗(yàn)中無死亡和感染,最終65只均進(jìn)入結(jié)果分析,2.2兩組間體質(zhì)量和血脂比較食源性肥胖組體質(zhì)量與血脂明顯高于對照組及食源性肥胖抵抗組(P<0.01),食源性肥胖抵抗組與對照組間體質(zhì)量與血脂差異無顯著性意義(P>0.05),見表1。2.3兩組患者空腹血糖,食源性肥抵抗大鼠空腹血糖,血糖水平比較見表1食源性肥胖組空腹胰島素水平明顯高于對照組及食源性肥胖抵抗組(P<0.01),而空腹血糖與對照組及食源性肥胖抵抗組差異無顯著性意義(P>0.05),食源性肥胖抵抗組和對照組的空腹血糖和血清胰島素水平差異無顯著性意義(P>0.05),見表2。2.4兩組食源性肥抵抗組和對照組葡萄糖輸入速度比較食源性肥胖組葡萄糖輸入速度明顯低于食源性肥胖抵抗組和對照組(P<0.01),食源性肥胖抵抗組和對照組的葡萄糖輸入速度差異無顯著性意義(P>0.05),見表2。食源性肥胖組成模率明顯高于食源性肥胖抵抗組和對照組(P<0.01),見表2。3型糖尿病大鼠造模方式的改良隨著糖尿病發(fā)病率的急速上升,糖尿病已經(jīng)成為世界流行病,其中95%為2型糖尿病,往往同時(shí)伴有超質(zhì)量和肥胖等。2型糖尿病的有效預(yù)防和治療迫在眉睫。良好的2型糖尿病模型是糖尿病發(fā)病機(jī)制、藥物治療研究的基礎(chǔ),努力探討和發(fā)現(xiàn)更加完善的2型糖尿病模型一直是國內(nèi)外糖尿病研究者的重要課題[10,11,12,13,14,15]。目前還沒有模型可以完全模擬2型糖尿病的病理生理機(jī)制,如國外常用的ob/ob小鼠、肥胖Zucker大鼠、自發(fā)性DMGK-Wistar大鼠及OLETF大鼠,其遺傳因素占主導(dǎo)作用,但不能模擬環(huán)境因素如飲食、肥胖在2型糖尿病發(fā)病中的作用。中國常用的傳統(tǒng)高脂飲食加鏈脲佐菌素造模方式被認(rèn)為具有外周胰島素抵抗和胰島功能輕度受損雙重特點(diǎn),在一定程度上符合人類2型糖尿病的病理過程,但高脂飲食僅能誘導(dǎo)50%大鼠發(fā)生胰島素抵抗,若應(yīng)用所有高脂飲食大鼠造模,所得模型必有部分不存在胰島素抵抗。這是實(shí)驗(yàn)對中國常用的傳統(tǒng)高脂飲食加鏈脲佐菌素造模方式進(jìn)行改良(篩選食源性肥胖大鼠注射鏈脲佐菌素),探索更加完善的2型糖尿病模型的理論基礎(chǔ)。與既往研究結(jié)果一致,在接受小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射前,與對照組及食源性肥胖抵抗組相比,食源性肥胖組大鼠血糖雖無明顯升高,但體質(zhì)量、血脂和血清胰島素濃度顯著上升,胰島素敏感性顯著下降,說明該組大鼠已產(chǎn)生嚴(yán)重的胰島素抵抗。而接受腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素后,B細(xì)胞受到輕度破壞,血糖明顯升高且持續(xù)存在。以上結(jié)果提示這種2型糖尿病大鼠模型具備以下特點(diǎn):(1)成功模擬了2型糖尿病的自然發(fā)病過程,在長期胰島素抵抗之后胰島B細(xì)胞失代償性功能受損,胰島素分泌減少。(2)血糖持續(xù)升高,提示該模型穩(wěn)定和有效。(3)鏈脲佐菌素的劑量很低,不會(huì)引起胰島B細(xì)胞嚴(yán)重破壞和其它臟器的損壞(小劑量鏈脲佐菌素引發(fā)凋亡,大劑量鏈脲佐菌素則引起胰島B細(xì)胞壞死)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示50只高脂飲食大鼠僅24只納入食源性肥胖組,伴有高胰島素血癥、胰島素抵抗和體質(zhì)量增加,余26只無明顯體質(zhì)量增加和胰島素抵抗。這是因?yàn)榉逝质且环N典型的環(huán)境因素與遺傳因素相互作用導(dǎo)致能量攝入與消耗失衡所造成的慢性疾病。在同樣的飲食條件下,有些人容易發(fā)展成為肥胖,而有些人則仍能維持正常體質(zhì)量。SD大鼠對食物營養(yǎng)成份敏感,但高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠并不是全部發(fā)生肥胖,而是存在一定的易感性差異,其中一半左右的大鼠發(fā)展為食源性肥胖,增加攝食,變的肥胖,同時(shí)伴有高胰島素血癥和胰島素抵抗;但仍有一部分大鼠的攝食量明顯低于食源性肥胖大鼠,維持正常體質(zhì)量,具有肥胖抵抗的特性,稱為飲食誘導(dǎo)肥胖抵抗大鼠。如不加選擇地給所有高脂飲食大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素,首先使得2型糖尿病成模率較低(目前國內(nèi)常用的高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠模型成模率往往不足100%),其次使得其中部分糖尿病大鼠無胰島素抵抗存在而更加類似1型糖尿病,后者正是目前國內(nèi)常用的高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素-大鼠2型糖尿病造模方式的缺陷所在。故實(shí)驗(yàn)對傳統(tǒng)2型糖尿病大鼠造模方式進(jìn)行改良:從高脂飲食SD大鼠中篩選出食源性肥胖大鼠,進(jìn)而腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素,誘發(fā)2型糖尿病,在確保高胰島素血癥和胰島素抵抗存在的同時(shí)提高了造模成功率(實(shí)驗(yàn)食源性肥胖組造模成功率達(dá)100%)。因而選擇食源性肥胖作為2型糖尿病造模對象,是一種成功的改良。由于從高脂飲食SD大鼠中僅能篩選出半數(shù)左右的食源性肥胖大鼠,進(jìn)行腹腔注射鏈脲佐菌素,另外一半左右的食源性肥胖抵抗大鼠則廢棄不用,在一定程度上增加了造模的造價(jià),但