糖尿病腎病模型的建立及評(píng)價(jià)

糖尿病腎病模型的建立及評(píng)價(jià)

糖尿病性腎炎（dn）是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥。并發(fā)癥率約為20%，約為5%8%的患者死于患有尿毒癥的藥物綜合征。目前DN的防治已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，而建立較好的DN模型是研究DN發(fā)病機(jī)制及防治的重要手段。目前有關(guān)DN的實(shí)驗(yàn)研究，模型建立方法各異，文獻(xiàn)表明，單側(cè)腎臟切除術(shù)后腹腔或尾靜脈注射鏈脲佐菌素(streptomycin,STZ)的方法報(bào)道較多，為近年來(lái)研究DN的主要造模方法。但實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行單側(cè)腎臟切除術(shù)后，死亡率高。目前STZ的給藥途徑有腹腔和尾靜脈2種，不同給藥途徑對(duì)模型穩(wěn)定性的影響有待于探討。為此本實(shí)驗(yàn)采用單側(cè)腎臟結(jié)扎術(shù)后，STZ誘導(dǎo)的方法。通過(guò)對(duì)血糖（glucose,Glu）及肌酐清除率（creatinineclearance,Ccr）的觀察，探討了單側(cè)腎臟結(jié)扎術(shù)后不同給藥途徑對(duì)模型的穩(wěn)定性及可重復(fù)性的影響。1材料和方法1.1材料表面1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，包括動(dòng)物，包括動(dòng)物，也包括動(dòng)物選用SD大鼠，雄性21只，體重（250±20)g，購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物批號(hào)SCXK（京）2002-0001。適應(yīng)性平衡飼養(yǎng)1周后，用于試驗(yàn)。1.1.2試劑和測(cè)定試劑STZ購(gòu)自Sigma公司，-20℃保存；尿蛋白(urineprotein,Upro)試紙購(gòu)自廣州市珠江生化試劑有限公司；肌酐（creatinine）測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。2%STZ溶液配制：2gSTZ:100ml0.1M枸櫞酸—枸櫞酸鈉緩沖液（pH4.2），使用前10min配制。1.1.3主要設(shè)備樂(lè)康全活力型血糖儀及樂(lè)康全試紙,德國(guó)；HZS-H水浴振蕩器，上海；UV-Vis8500型紫外分光光度計(jì)，上海。1.2方法1.2.1小組將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按體重隨機(jī)分為空白對(duì)照組（N）、腹腔模型組（CF）及尾靜脈模型組（CW)3組，每組7只。1.2.2模型建立及建立實(shí)驗(yàn)大鼠禁食12h后，CF組、CW組大鼠10%水合氯醛300mg/kg體重腹腔麻醉下行左側(cè)腎臟結(jié)扎術(shù),結(jié)扎方法為：沿腎蒂同時(shí)結(jié)扎腎臟動(dòng)靜脈及輸尿管。N組大鼠不做手術(shù)處理。術(shù)后2周，大鼠禁食18h,CF組一次性腹腔注射2%STZ50mg/kg體重，即具體給藥量為2.5ml/kg體重；CW組一次性尾靜脈注射2%STZ40mg/kg體重，即具體給藥量為2.0ml/kg體重；N組腹腔注射枸櫞酸緩沖液2.5ml/kg體重。注射藥物后大鼠自由攝食水。以造模72h非空腹尾靜脈血糖水平≥13.8mmol/L作為模型成立選擇標(biāo)準(zhǔn)。CF組模型8周成活率為90%。1.2.3血胱氨酸組ccr大鼠模型成立后，代謝籠收集24h尿液，行Upro定性檢測(cè)并記錄尿量，取尿樣-20℃保存待測(cè)定尿肌酐（urinecreatinine,Ucr）。內(nèi)眥取血，4℃過(guò)夜，3500r/min離心15min，收集血清，-20℃保存，待測(cè)定血肌酐（serumcreatinine,Scr）。依公式：Ccr=Ucr×24h尿量/Scr計(jì)算Ccr。同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行10d內(nèi)非空腹尾靜脈Glu動(dòng)態(tài)變化的觀測(cè)。1.2.4測(cè)定的肌腱采用苦味酸法，依試劑盒操作要求進(jìn)行。1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以百分率及±s表示,采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，百分率比較采用確切概率法。并比較各組10d內(nèi)平均Glu的變異情況。2結(jié)果2.1表1顯示了模型成功的比較，驗(yàn)證了兩組模型的成功率p0.052.2比較的目造模72h后，CF組Upro定性試驗(yàn)呈陽(yáng)性反應(yīng)，但強(qiáng)弱不等。N組Upro定性試驗(yàn)呈陰性反應(yīng)。2.3顯著差異檢驗(yàn)如表2所示，CF組10d內(nèi)平均Glu大于CW組，呈顯著差異P<0.05。CF、CW兩組10d內(nèi)Glu變異系數(shù)的比較表明：CF組變異系數(shù)小于CW組，且從圖1、2可以看出CF組的Glu隨時(shí)間的變化較一致。2.4n和cf兩組ccr的比較如表3所示，N、CF兩組Ccr的比較表明：與N組比較，CF組Ccr升高，呈顯著差異P<0.05。3單次給藥途徑及方式DN是DM嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，是由糖代謝異常引起的一系列代謝紊亂導(dǎo)致的腎小球硬化，主要是指腎小球毛細(xì)血管基底膜增厚、系膜區(qū)基底膜樣物質(zhì)沉積。隨著對(duì)DN發(fā)病機(jī)制的深入研究，DN治療藥物的篩選及其藥理研究也不斷增多,成功地模擬、建立理想的動(dòng)物模型是研究DN的關(guān)鍵。目前，糖尿病動(dòng)物模型制備主要采用化學(xué)藥物誘導(dǎo)的方法。采用四氧嘧啶損害胰島β細(xì)胞功能的模型制備是最早的糖尿病制備法，因其對(duì)肝腎損害較大，不利于糖尿病并發(fā)癥的研究，已很少應(yīng)用。STZ為四氧嘧啶的換代藥物，它不僅具有高特異性殺傷胰島β細(xì)胞作用，對(duì)肝腎損害亦明顯小于四氧嘧啶，是近年來(lái)誘導(dǎo)糖尿病發(fā)生的首選藥物。目前國(guó)內(nèi)有關(guān)DN實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽渲饕捎?種：（1)STZ誘導(dǎo)DM，伴隨病情發(fā)展使之發(fā)生DN。（2）切除單側(cè)腎臟，再給予STZ直接誘導(dǎo)DN。比較2種造模方法：前者在糖尿病發(fā)展至腎小球基底膜增厚一般需要3～6個(gè)月。近有文獻(xiàn)報(bào)道單純腹腔注射≥60mg/kg體重STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠發(fā)病1周后腎小球直徑開始增加、基地膜開始增厚，可以用于研究糖尿病早期腎臟改變。而后者人為切除單側(cè)腎臟，造成對(duì)側(cè)腎臟肥大、高濾過(guò)，在此基礎(chǔ)上給予STZ直接誘導(dǎo)DN，縮短了DN發(fā)生的早期階段，能夠較好地模擬DN，但模型成活率低（據(jù)經(jīng)驗(yàn)單側(cè)腎臟切除術(shù)+STZ誘導(dǎo)法4周存活率為50%）。而采用單側(cè)腎臟結(jié)扎法+STZ誘導(dǎo)DN模型國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道。為此本實(shí)驗(yàn)以單側(cè)腎臟結(jié)扎法代替切除術(shù)，配合STZ誘導(dǎo)的方法制備DN模型，對(duì)不同給藥途徑及給藥劑量誘導(dǎo)模型血糖及成模率進(jìn)行比較，并在此基礎(chǔ)上對(duì)CF模型鼠進(jìn)行Upro定性及Ccr的觀察，探討了該模型的穩(wěn)定性及可行性。結(jié)果表明：2組模型大鼠，模型成功率比較顯示：CW組及CF組模型成功率無(wú)顯著差異（P>0.05）。但2組間Glu比較顯示：CF組10d平均Glu大于CW組，呈顯著差異（P<0.05）。Glu變異系數(shù)比較顯示：CF組模型Glu變異系數(shù)小于CW組，變化趨勢(shì)穩(wěn)定。考慮可能與STZ劑量及經(jīng)尾靜脈藥物吸收不完全有關(guān)系。可以認(rèn)為不同給藥途徑、不同給藥劑量均可以使單側(cè)腎臟結(jié)扎法大鼠的血糖達(dá)到DM模型遴選標(biāo)準(zhǔn)，但與尾靜脈注射相比，腹腔注射2%STZ50mg/kg體重的方法更適合于實(shí)驗(yàn)研究。肌酐是人體內(nèi)肌酸代謝產(chǎn)物，不與血漿蛋白結(jié)合，可自由通過(guò)腎小球，不被腎小管重吸收，在Scr無(wú)異常增高時(shí)不為腎小管排泄。所以可以用Ccr來(lái)表示腎小球?yàn)V過(guò)率（glomerularfiltrationrate,GFR）,作為判斷DN出現(xiàn)腎臟肥大、高濾過(guò)的指標(biāo)。Upro的出現(xiàn)反映腎小球?yàn)V過(guò)屏障的損傷程度。因此本實(shí)驗(yàn)在考察兩模型鼠Glu變化的基礎(chǔ)上，對(duì)正常及腹腔模型鼠進(jìn)一步進(jìn)行Upro定性及Ccr的比較。結(jié)果表明：CF組大鼠Upro定性呈陽(yáng)性，Ccr顯著升高（