臨床免疫學檢驗-課件-第16章-細胞因子與細胞粘附因子的測定52

第十六章

細胞因子與黏附分子的檢測

目

錄

一、概述

二、臨床常用測定方法

三、細胞因子與細胞黏附分子測定的臨床應用

第一節(jié)

概

述

一、細胞因子（cytokine）

細胞因子的定義：

?活化的免疫細胞及某些基質(zhì)細胞所分泌的;?小分子糖蛋白（8~30kD）;?大多單體、少數(shù)雙聚體或三聚體

?結合細胞表面相應受體發(fā)揮生物學效應；

?介導和調(diào)節(jié)免疫應答及炎癥反應。

細胞因子的分類：

?淋巴因子（lymphokine）：淋巴細胞產(chǎn)生的因子；

?單核因子（monokine）：單核細胞產(chǎn)生的因子；

?集落刺激因子(colonystimulatingfactor,CSF)：刺激骨髓干細胞成熟的因子，如GM-CSF、M-CSF、EPO等；

?白介素（interleukin，IL）：白細胞間相互作用的因子，如IL-1~IL-38；

?腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor,TNF)，

如TNF-α、TNF-β；

?干擾素(interferon,IFN)，如IFN-α、IFN-β和IFN-γ。

一、細胞因子（cytokine）

（一）細胞因子的共同特性與作用方式

自分泌（autocrine)：

旁分泌（paracrine)：

內(nèi)分泌（endocrine)：

作用于分泌自身的細胞，是腫瘤細胞自律生長的重要機制。如白血病細胞產(chǎn)生的IL-6。

作用于臨近的細胞，細胞因子血清濃度低，常規(guī)方法難檢測。如DC細胞產(chǎn)生IL-12，作用于T細胞。

即激素作用方式，通過血液循環(huán)系統(tǒng)，作用遠處的靶器官，引起全身效應。有較高的血清濃度，如TNF

自分泌autocrine

內(nèi)分泌endocrine血液循環(huán)

遠距離作用

旁分泌paracrine作用于比鄰細胞

作用于分泌細胞自身

細胞因子分泌的方式

（二）細胞因子的作用特點

多效性（pleiotropism）

?一種細胞因子可由不同的細胞在不同的條件下產(chǎn)生；

?一種細胞因子可作用多種靶細胞；

肥大細胞

胸腺細胞

BIL-4活化、增殖、分化

增殖

增殖

重疊性（redundancy）

?幾種不同的細胞因子作用于同一靶細胞，產(chǎn)生相同或相似的生物學效應；

IL-2、

IL-4、

IL-5均有刺激B細胞增殖的功能

B協(xié)同性（synergy）

?一種細胞因子可增強另一種細胞因子的功能；

IL-4+IL-5提高誘導IgE類別轉(zhuǎn)換

B拮抗性（antagonism）

?一種細胞因子可抑制另一種細胞因子的功能；

IL-4IFN-γ阻斷IL-4誘導IgE類別轉(zhuǎn)換

BIFN-g網(wǎng)絡性——細胞因子以網(wǎng)絡的形式發(fā)揮作用

Th2

Th1IL-4

Th0IL-4、IL-5、IL-6、IL-10

BIFN-γ

殺傷細胞內(nèi)感染的病原菌

抗體

IL-2、IFN-γ、TNF-α

.巨噬細胞

CTL殺傷感染或突變細胞

IL-3、GM-CSF造血細胞

白細胞

DC（三）細胞因子受體的共同特征與作用方式

?細胞因子受體：通常存在細胞表面，跨膜蛋白，細胞因子名稱后面加R表示，如IL-1R（IL-1受體）。

?細胞因子受體結構

?胞外區(qū)：含重復結構，識別結合細胞因子的部位；

?跨膜區(qū)

?胞內(nèi)區(qū)：啟動胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導；

?細胞因子受體的類型

?免疫球蛋白受體家族（IgR-F)；

?細胞因子受體家族（CkR-F)，造血因子受體家族

?干擾素受體家族（IFNR-F)?腫瘤壞死因子家族（TNFR-F)?七次跨膜受體家族（STSR-F)?蛋白酪氨酸激酶受體家族（PTKR-F)（三）細胞因子受體的共同特征與作用方式

七次跨膜受體家族

干擾素受體家族

免疫球蛋白受體家族

IL-1IL-18TNF-α、TNF-β、CD40等

細胞因子對Th細胞亞群的調(diào)節(jié)作用

（四）T細胞相關細胞因子功能

胞內(nèi)病原體

普通細菌等

（四）T細胞相關細胞因子功能

1.介導細胞免疫的Th1細胞因子

2.介導體液免疫的Th2型細胞因子

3.介導免疫調(diào)節(jié)和免疫抑制效應的Th3型細胞因子

4.介導炎癥反應的Th17型細胞因子

1.介導細胞免疫的Th1細胞因子

?主要分泌IFN-γ、TNF-β和IL-2?IFN-γ：由激活的CD4+T、CD8+T及NK細胞產(chǎn)生。且受IL-12和18的調(diào)控，抗感染作用。

?IL-12：誘導Th0分化為Th1，是連接早期天然免疫和獲得性免疫的橋梁。

?IL-18：多向調(diào)節(jié)性，抗腫瘤強、促進炎癥因子

?IL-2：是引起T細胞增殖的主要因子。

?IL-4和IL-5；參與B細胞活化、增殖和成熟，參與體液免疫應答。

?其他細胞因子或受體：IL-4R、IL-10、IL-13、IL-13RA1、IL-13RA3、IL-1R1、IL-1R2等。

2.介導體液免疫的Th2型細胞因子

?TGF-β

?多功能細胞因子；

?在免疫調(diào)節(jié)、造血、腫瘤免疫、炎癥反應起作用。

?IL-10家族

?由IL-10、19、20、22、24及26組成，功能各異。

?

IL-10是公認的免疫抑制的細胞因子，抑制Th1細胞的應答、巨噬細胞的抗原提呈功能及NK細胞的活性。

?抗炎癥作用，可應用臨床（治療T細胞功能紊亂的免疫疾病）

3.介導免疫調(diào)節(jié)和抑制效應的Th3細胞因子

?IL-17?由Th17細胞、單核細胞分泌的促炎性因子；

?在抗腫瘤、炎性疾病如肺部疾病、哮喘、類風濕關節(jié)炎、器官移植等發(fā)揮作用。

?TNF?固有免疫主要細胞因子；

?特異性免疫應答和炎癥反應間的重要連接紐帶；

?刺激白細胞黏附，刺激趨化因子的產(chǎn)生，殺死病原體，參與組織修復、血管形成等

4.介導炎癥反應的Th17細胞因子

二、細胞黏附分子（cell-adhesionmolecules）

?由細胞產(chǎn)生，介導細胞間及細胞與細胞外基質(zhì)間相互接觸和結合的分子；

?位于細胞表面或可溶形式；

?以配體-受體相結合的形式發(fā)揮作用；

?介導黏附；

?參與細胞識別、信號轉(zhuǎn)導與活化、細胞伸展和移動、增殖與分化。

（一）細胞表面黏附分子特性

?本質(zhì)：跨膜糖蛋白，

?組成：

?胞外區(qū)：識別配體

?跨膜區(qū)

?胞內(nèi)區(qū)：細胞骨架成分直接或間接的相連，以激活信號轉(zhuǎn)導途徑。

?種類：整合素、選擇素超家族、Ig超家族、可溶性黏附分子和鈣黏素家族等

（二）黏附分子的主要生物學功能

?參與細胞的信號轉(zhuǎn)導與活化、細胞的伸展和移動、細胞的生長及分化；

?促進淋巴細胞的活化、增殖、分化或免疫殺傷作用；

?參與炎癥過程中白細胞與血管內(nèi)皮細胞黏附和滲出。

（三）黏附分子與炎性疾病

1.黏附分子與動脈粥樣硬化

?ICAM與P-選擇素顯著增高，可募集單核細胞、巨噬細胞的聚集和侵入，在已有損傷條件下，加重損傷，VCAM在動脈損傷的后期階段起重要作用。

2.黏附分子與腎臟疾病

?ICAM是腎臟炎癥的主要標志之一；

?在急性腎衰中，腎小球內(nèi)皮細胞，ICAM-1表達明顯增加；

?慢性梗阻性腎病患者，ICAM-1持續(xù)表達可促進炎癥細胞的激活或持續(xù)浸潤，導致腎小管細胞的損傷。

單核巨噬細胞在動脈粥樣硬化中的作用

PeterLibby,Nature,20023.黏附分子與肝臟疾病

?在肝纖維化，整聯(lián)素表達上調(diào)，促進細胞外基質(zhì)在肝臟組織的沉積，啟動肝纖維化。

?慢性病毒肝炎血清中E-選擇素、ICAM-1、VCAM-1、IL-1等水平增高。

?酒精肝硬化ICAM-1明顯增加，肝移植，P-選擇素濃度明顯增高,是血栓標志物。

4.黏附分子與自身免疫性疾病

?SLE:皮膚損傷部位、及其他部位的E-選擇素、VCAM-1和ICAM-1表達明顯高于正常人。

?類風濕關節(jié)炎滑膜組織中發(fā)現(xiàn)E-選擇素的高表達。

（三）黏附分子與炎性疾病

第二節(jié)

臨床常用的測定方法

常用測定方法

基因水平

蛋白水平

?mRNA表達水平

?RT-PCR技術定性或定量測定

?研究領域

?生物學檢測法

?靶細胞殺傷、細胞增殖、細胞病變抑制法等

?免疫學測定

?蛋白含量測定

一、生物學檢測方法

?原理：根據(jù)細胞因子特定的生物學效應設計的，應用相應的指示系統(tǒng)與已知活性細胞因子標準品或待測細胞因子相互作用，觀察指示系統(tǒng)的變化來測定細胞因子的活性，結果以活性單位表示。

?常用指示系統(tǒng)

?細胞增殖或增殖抑制法

?靶細胞殺傷法

?細胞病變抑制法

?…

IL-2、IL-6刺激或抑制某些細胞的增殖

TNF、IFN對某些腫瘤細胞有溶細胞或抑制細胞生長的活性

IFN抗病毒活性

二、免疫學測定法

?ELISA?化學發(fā)光酶免疫實驗

?流式細胞術

?ELISPOT(一)ELISA方法

?用于細胞因子、可溶性細胞因子受體或可溶性粘附因子的定性或定量測定。

?基本方法有：雙抗體夾心法、間接法和抗原競爭法。雙抗體夾心法是細胞因子測定的最常用方法。

?特點：

?優(yōu)點：批量檢測，成本低廉，易推廣，操作簡單；

?缺點：靈敏度低，不能區(qū)分生物學活性。

1.檢測標本：

（1）血清、關節(jié)液、胸腔液、腦脊液或腹腔液等體液：

?用于細胞因子、可溶性黏附分子、可溶性細胞因子受體等的檢測

?正常情況下，血清中多數(shù)細胞因子含量均低，可選用敏感性高的流式細胞術；

?在病理狀態(tài)下，細胞因子或可溶性黏附分子表達增加，首選ELISA法。

(一)ELISA方法

?只用于細胞因子和可溶性細胞因子受體的檢測。

?檢測時注意檢測條件：

?選擇適當刺激劑：不同刺激劑對細胞因子促分泌效應不同；

?適時檢測：細胞生長狀態(tài)和細胞因子分泌動態(tài)變化；

?選擇適當?shù)臋z測時點：最大分泌峰時間各異；

（2）細胞體外培養(yǎng)后上清液

(一)ELISA方法

?標本嚴重溶血：血紅蛋白的血紅素基團的過氧化物酶活性干擾

?微生物污染：可刺激IL-1、IL-6等細胞因子的分泌，影響結果準確性

?離體后標本中細胞繼續(xù)分泌細胞因子，或與細胞上的受體結合或降解

2.干擾因素

(一)ELISA方法

?用于體液中細胞因子或可溶型細胞因子受體的定量測定；

?方法：雙抗體夾心法，ALP或HRP?特點：靈敏度高，線性范圍寬、試劑穩(wěn)定，可自動化檢測。

(二)化學發(fā)光酶免疫試驗

?流式細胞分析法，是基于熒光抗體染色技術并借助流式細胞儀高分辨力所建立的方法；

?主要用于細胞內(nèi)細胞因子和細胞表面粘附分子的檢測；

?可進行單個細胞水平的細胞因子或粘附因子的檢測；

?精確判斷不同細胞亞群細胞因子和膜分子的表達情況；

?可實現(xiàn)半定量分析。

(三)流式細胞術

1．分離和培養(yǎng)待檢細胞

2．細胞破膜與固定

3．封閉非特異性結合位點

4．染色與分析

基本步驟

(三)流式細胞術

1.分離和培養(yǎng)細胞（PMBC或體外培養(yǎng)的細胞）

?需進行細胞刺激，刺激物（活化劑）的選擇視待測細胞及細胞因子而定，如：

?T細胞活化劑（PHA，PMA和CD3單抗等)；

?B細胞活化劑(LPS，葡萄球菌腸毒素等）；

?單核細胞活化劑（LPS等）；

?需蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑

?如莫能菌素，阻止細胞因子分泌，利于胞內(nèi)細胞因子檢測

?目的：便于熒光抗體進入胞內(nèi)與細胞因子結合；

?常用破膜劑：Triton100，皂素；

?細胞固定：甲醛或乙醇使蛋白變性，防止其流失，且使其固定。常用的細胞固定劑4%多聚甲醛。

2.細胞破膜與固定

?目的：阻斷特異性抗體與非特異性位點的結合，提高方法特異性；

?方法：采用封閉劑如含5%脫脂奶粉、正常血清或不含細胞因子特異抗體的同種免疫球蛋白處理。

3.封閉非特異性結合位點

?熒光抗體染色，流式細胞儀分析熒光陽性細胞百分率和熒光強度。

?同時檢測同一細胞內(nèi)2種及以上細胞因子的表達。

?如同時檢測Th細胞IFN-γ和IL-4的表達區(qū)分

Th1細胞Th2細胞

?細胞表面的黏附分子或細胞因子受體：

?無需作細胞破膜和固定。

?待測細胞是新鮮分離或培養(yǎng)的活細胞，保持良好狀態(tài)。

4.染色與分析

?標本處理：

?新鮮分離或培養(yǎng)的細胞，狀態(tài)良好。

?避免使用EDTA抗凝，絡合鈣，限制鈣依賴性激活途徑，推薦用肝素鈉

?標本8h內(nèi)分析

5.注意事項

?對照選擇

?未刺激對照：包含蛋白轉(zhuǎn)運劑的未刺激對照

?激活對照：測細胞表面的CD69的表達

?同型對照：消除抗體非特異性結合。采用熒光標記抗體同來源、同標記、同劑量和亞型的免疫球蛋白。

?熒光素選擇

?低表達、同時檢測單一或多種細胞因子：PE（澡紅蛋白）

?高表達：FITC（異硫氰酸熒光素）

5.注意事項

(四)ELISPOT抗細胞因子抗體包被固相載體

加入待檢細胞

刺激或不刺激

培養(yǎng)一定時間

分泌的細胞因子+Ab結合

加入酶標抗體、底物顯色

洗滌去除細胞

形成斑點

每個斑點代表單個分泌細胞因子的細胞

斑點深淺與含量相關

基

本

方

法

方法評價：

?優(yōu)于傳統(tǒng)的檢測方法，靈敏度高；

?ELISA是整體水平上的檢測；

?ELISPOT是單細胞水平的檢測；

(四)ELISPOT?測定是含量，與活性不一定成正比；

?結果與抗體來源及親和力有關；

?敏感性相對較低；

?可溶性受體干擾結果。

?特異性高；

?操作簡便；

?重復性好，易標準化。

(五)免疫學測定方法評價

第三節(jié)

細胞因子與細胞黏附分子測定的臨床應用

一、臨床應用的方面

?特定疾病的輔助診斷；

?機體免疫狀態(tài)的評估；

?臨床疾病治療效果的檢測和指導用藥；

?疾病預防的應用。

（一）細胞因子在檢測特定疾病診斷中的意義

?感染性疾病、免疫炎癥、移植排斥反應等發(fā)生時，常出現(xiàn)TNF、IL-1、IL-6、IFN-γ等表達增加；

?TNF和IL-6：是肝臟損傷的重要炎癥介質(zhì)；

?TNF、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1等水平鑒別診斷類風濕關節(jié)炎和骨性關節(jié)炎。

?疾病過程中，細胞因子和黏附分子表達異常，還可反映疾病進程。

（二）黏附分子檢測在特定疾病診斷中的意義

?E-鈣粘素：腸道特異的細胞黏附分子，腸型胃腺癌異位表達，腺癌分化差的區(qū)域表達減少，免疫組化分析可作為胃腺癌及其分化程度的早期輔助診斷指標。

?CD44：介導細胞間、細胞與外基質(zhì)間的黏附，過量表達CD44變異體與腫瘤的發(fā)生和擴散有關，可預示患者體內(nèi)有腫瘤轉(zhuǎn)移的危險性。

?sICAM-1和sVCAM-1：判斷移植排斥反應的指標，升高提示有發(fā)生排斥反應的可能。

評估機體的免疫狀態(tài)、判斷治療效果及預后

※有助于判斷機體免疫狀態(tài)；

※其過高或過低表達均系免疫調(diào)節(jié)異常的結果，導致疾病的發(fā)生；

※作為觀察治療效果和判斷預后的重要指標；

※在疾病治療中，發(fā)揮重要作用；

※接受治療的患者進行細胞因子水平的監(jiān)測，對保證治療效果具有指導意義。

。

二、臨床應用原則

（一）方法的聯(lián)合應用

?方法多樣，各有利弊

–高敏感性方法：特異性的降低、廢棄物難處理；

–活性測定方法：定性試驗，不能準確定量。

–基因分析法：利于細胞內(nèi)分析，