淺析海洋中的離子通道類毒素

淺析海洋中的離子通道類毒素

離子通道中毒是指特定功能于靶通道受體引起的轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致電子通道功能的變化，從而導(dǎo)致整個(gè)身體的生理功能紊亂。其中電壓門控Na+通道(VGSC)是離子通道超家族中第一個(gè)從分子水平被人們所認(rèn)識(shí)的離子通道,通常由一個(gè)a型大亞基單元(260kD)和一個(gè)或多個(gè)β型小亞基單元組成。VGSC在神經(jīng)元及大多數(shù)可興奮性細(xì)胞動(dòng)作電位的形成以及對神經(jīng)細(xì)胞的功能和生物電信息傳播起著極其重要的作用,VGSC的功能異常、表達(dá)量異常以及特定功能域的突變都能影響細(xì)胞膜上的信號(hào)產(chǎn)生和傳導(dǎo),嚴(yán)重則導(dǎo)致生理性病變。在電壓門控Na+通道上至少存在7個(gè)不同的神經(jīng)毒素靶受體結(jié)合位點(diǎn),當(dāng)不同的毒素作用Na+通道的不同位點(diǎn)會(huì)產(chǎn)生不同的毒理作用,主要分為三大類:鈉通道阻滯劑、鈉通道激活劑和鈉通道失活劑。在赤潮藻毒素中,麻痹性貝毒(PSP)、神經(jīng)性貝毒(NSP)和西加魚毒素(CFP)都是通過作用于細(xì)胞膜Na+通道來影響細(xì)胞的正常生理功能。另外,海洋中還存在許多如河豚毒素、芋螺毒素、?？舅亍⑽r夷扇貝毒素等,都對Na+通道受體有高選擇性和高親和性,從而影響與受體有關(guān)的一系列細(xì)胞調(diào)控活動(dòng),具有廣泛的神經(jīng)系統(tǒng)活性、心血管系統(tǒng)活性和細(xì)胞毒活性。本文對海洋中幾種主要的鈉通道受體神經(jīng)毒素及其檢測方法做一概述,為有關(guān)研究提供參考。1鈉通道阻滯劑是一類特異性的與Na+通道位點(diǎn)1結(jié)合的毒素,主要包括麻痹性貝毒(PSP)和河豚毒素(TTX)等。1.1-4-三氮素-5-三基亞胺wsp的結(jié)構(gòu)及毒性PSP是指主要存在于貝類體內(nèi)、化學(xué)結(jié)構(gòu)以石房蛤毒素(STX)為代表、攝食后可產(chǎn)生麻痹作用的海洋生物毒性物質(zhì)的總稱,主要由甲藻中的亞歷山大藻屬(Alexandrium)、膝溝藻屬(Gonyaulax)、裸甲藻屬(Gymnodinium)等分泌產(chǎn)生,現(xiàn)已有研究證明生活在淡水中的藍(lán)細(xì)菌也能產(chǎn)生PSP毒素。另外,不僅不同有毒藻產(chǎn)生的PSP毒素種類和含量不同,而且同一種有毒藻產(chǎn)生的毒素種類和含量在生物的不同生長階段也不同,同時(shí)毒素產(chǎn)生狀況還受到生物因素(如細(xì)菌)和非生物因素(如光照、溫度、營養(yǎng)鹽等)的影響。PSP是目前世界上分布最廣、事故發(fā)生頻率最高的一種貝毒,它存在于世界范圍之內(nèi),包括美國東西兩岸,特別在阿拉斯加有大量動(dòng)物攜帶PSP毒素,現(xiàn)已在鮐魚內(nèi)臟,龍蝦及許多蟹類中也發(fā)現(xiàn)了PSP毒素。至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的麻痹性貝毒毒素有近30種,目前已經(jīng)明確了25種成分的具體結(jié)構(gòu),根據(jù)分子中R4基團(tuán)不同,可分為氨基甲酸酯類、N-磺酰氨甲?；悺⒚摪奔柞；?、脫氧脫氨甲酰基類[10~12],它們都是以STX為骨架和取代基不同而衍生出的多種化合物組成,由于多疊六元環(huán)基本結(jié)構(gòu)衍生出的個(gè)別位置上基團(tuán)的差別,其毒性也略有差別。STX在分子量較小的毒素中為毒性較高者,是眼鏡蛇毒素毒性的80倍,腹腔注射小鼠的半致死劑量為9~11.6μg/kg,0.5mg足以使人致死。PSP通常與神經(jīng)細(xì)胞膜結(jié)合,能造成細(xì)胞膜電壓門控的Na+通道(VSSC)高親和力障礙,影響或阻止Na+內(nèi)流,從而使正常的動(dòng)作電位無法形成,特異性干擾神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)過程,使隨意肌松弛麻痹,進(jìn)而導(dǎo)致一系列中毒癥狀。SapseAM等研究表明,Na+通道被STX抑制的原因是通道外膜胍基和羧基相互作用而不能結(jié)合Na+。近年有研究發(fā)現(xiàn),STX除了作用于Na+通道外,也結(jié)合Ca2+、K+通道,煙胺比林一氧化氮合成酶,STX代謝酶和2種循環(huán)流蛋白(一種運(yùn)鐵蛋白和一種獨(dú)特的血流蛋白),是一種多受體靶位的海洋生物毒素。麻痹性貝毒的潛伏期從數(shù)分鐘到數(shù)小時(shí)不等,主要中毒癥狀表現(xiàn)為面部、四肢肌肉麻痹,頭疼惡心、流涎發(fā)熱等,嚴(yán)重的會(huì)因呼吸肌麻痹而導(dǎo)致死亡。1.2河羊魚的致病性TTX是豚毒魚類及其他生物體內(nèi)含有的一種毒性極強(qiáng)、相對分子質(zhì)量較小的非蛋白質(zhì)神經(jīng)毒素,為氨基全氫化喹唑啉型化合物,分子式為C11H17O8N3,相對分子質(zhì)量319.27,是由1個(gè)碳環(huán),1個(gè)胍基,6個(gè)羥基組成,在C-5和C-10位有一個(gè)半醛糖內(nèi)酯連接著的分開的環(huán)。魚體中的含毒量在不同部位和季節(jié)有差異,其中卵巢含量最多,肝臟次之,血液、眼睛、腮和皮膚含量較少,一般肌肉中不含有毒素,但魚死后內(nèi)臟毒素可滲入肉中。河豚的毒性比劇毒的氰化鈉還要強(qiáng)1000多倍,對人的致死劑量為6μg/kg~7μg/kg,小鼠腹腔注射的LD50為8μg/kg。由于河豚魚味道鮮美,營養(yǎng)豐富,一些亞洲國家如中國、日本等一直有食用的習(xí)慣,所以因食用河豚魚中毒的事件屢有發(fā)生,中毒死亡的人數(shù)占食物中毒總死亡人數(shù)的33%。TTX的作用機(jī)制與PSP相似,為細(xì)胞膜Na+通道的選擇性快速阻斷劑,其活性基團(tuán)是1、2、3位的胍胺基和C4、C9、C10位的羥基,受體位于可興奮細(xì)胞膜外側(cè)、鈉通道外口附近,TTX與鈉通道受體部位I結(jié)合后,阻止Na+接近通道的外口,使Na+不能通過通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。TTX的潛伏期一般為0.5h~3h,主要表現(xiàn)為對神經(jīng)肌肉系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的影響,中毒的典型癥狀是神經(jīng)肌肉麻痹,口唇麻木、血壓下降、心率失常,對呼吸系統(tǒng)產(chǎn)生抑制作用等。2上的毒素是一類作用于Na+通道靶受體結(jié)合位點(diǎn)5上的毒素,包括雪卡毒素(Ciguatoxin,CTX)、短裸甲藻毒素(Brevetoxins,BTX)等。2.1西加魚毒素sd雪卡毒素(CTX)CTX主要是由有毒岡比爾盤藻(Gambierdiscustoxicus)和凹面原甲藻(Prorortmmconcavum)等產(chǎn)生,被一些深海珊瑚魚類食用后在魚體內(nèi)不斷積累和同化,并通過食物鏈傳遞,濃度和毒性逐級(jí)增強(qiáng)。帶有雪卡毒素的魚類主要存在于太平洋、印度洋、大西洋等熱帶、亞熱帶海域。靈長類動(dòng)物的半致死量為2.0μg/kg,食入0.1μg的雪卡毒素可使一個(gè)成年人致病。雪卡毒素是一種很強(qiáng)的鈉通道激活劑,能增強(qiáng)細(xì)胞膜對Na+的通透性,產(chǎn)生強(qiáng)的去極化,引起神經(jīng)肌肉興奮性傳導(dǎo)發(fā)生改變,但它們不影響通道的離子選擇通透性[25~27]。據(jù)報(bào)道西加魚毒素有175種臨床癥狀,涉及身體各個(gè)部分,主要包括消化系統(tǒng),心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,一般在進(jìn)食1~6h后開始出現(xiàn)癥狀,腹瀉、嘔吐、惡寒,口唇麻木、溫度感逆轉(zhuǎn)、肌肉及關(guān)節(jié)疼痛,并伴有脈搏變慢、血壓下降等循環(huán)系統(tǒng)障礙,嚴(yán)重者可出現(xiàn)瞳孔散大,共濟(jì)失調(diào),四肢失去知覺、癱瘓,甚至死亡[28~30]。另外,該中毒癥狀在人體中短時(shí)間內(nèi)很難消失,神經(jīng)癥狀持續(xù)時(shí)間長短不一,長者可達(dá)數(shù)月或數(shù)年之久,有研究發(fā)現(xiàn)中毒后22周仍可在血清中檢測到雪卡毒素。2.2進(jìn)行貝毒的藻類短裸甲藻毒素(BTX)BTX是神經(jīng)性貝毒(NSP)的主要活性成份,由短凱倫藻Kareniabrevis分泌產(chǎn)生。NSP是到目前為止危害范圍較小的一類毒素,主要分布在美國墨西哥灣一帶,不過近年來在美國南大西洋海岸、歐洲、新西蘭也發(fā)現(xiàn)了有毒藻短凱倫藻的存在,表明可能發(fā)生神經(jīng)性中毒事件的區(qū)域也在不斷擴(kuò)大,我國亦已發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)生神經(jīng)性貝毒的藻類。BTX是一類耐熱耐酸的脂溶性梯型聚醚類化合物,能溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有機(jī)溶劑和10g/LNaOH溶液。短凱倫藻至少產(chǎn)生10種類似物,根據(jù)毒素主要結(jié)構(gòu)可將其分為Ⅰ型毒素(BTX-2)和Ⅱ型毒素(BTX-3),其中Ⅰ型毒素是短凱倫藻產(chǎn)生的主要毒素。另外,BTX在貝類體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化出新的異構(gòu)體,對小鼠的半致死量為LD50為50μg/kg,美國安全標(biāo)準(zhǔn)為20MU/100g貝肉組織。NSP也是通過作用于Na+通道位點(diǎn)5而產(chǎn)生毒害作用,它所導(dǎo)致的中毒癥狀與西加魚毒中毒非常相似,以胃腸道和神經(jīng)癥狀為主,如神經(jīng)麻木、冷熱感覺顛倒、肌肉痛、眩暈等。此外,神經(jīng)性貝毒還有一種非常獨(dú)特的致毒途徑,即通過形成氣溶膠,作用于人類呼吸系統(tǒng),導(dǎo)致類似哮喘的癥狀。與麻痹性貝毒阻斷Na+內(nèi)流相反,神經(jīng)性貝毒的活性成分BTX可以誘導(dǎo)Na+內(nèi)流,從而導(dǎo)致肌肉和神經(jīng)細(xì)胞的去極化,但其效能能夠被作用于Na+通道位點(diǎn)1的毒素如STX和TTX完全消除。3鈉通道失活劑主要包括特異性結(jié)合Na+通道位點(diǎn)3的?？舅?AP)和作用于Na+通道位點(diǎn)6的δ-芋螺毒素(δ-CNTX)等。3.1na+通道故障診斷AP是由刺胞動(dòng)物?？?Seaanemones)產(chǎn)生的海洋肽類毒素,分子量小于5000的是神經(jīng)毒素,對細(xì)胞膜電壓依賴性的Na+通道有高特異性,與位點(diǎn)3結(jié)合后,抑制Na+通道失活,從而加速Na+的通透性,引起持續(xù)的去極化作用,導(dǎo)致一系列的中毒改變,特別是心臟和神經(jīng)系統(tǒng)是其作用的主要部位。AP主要以來自黃海海葵的Ap-A和Ap-B(49個(gè)氨基酸殘基組成,3對二硫鍵)為典型代表,具有強(qiáng)心作用,認(rèn)為是治療心衰的極有潛力的藥物,目前Ap類強(qiáng)心多肽正開發(fā)用于充血性心力衰竭和肌無力的治療。3.2-cntx抑制劑NTX是從軟體動(dòng)物芋螺(conus)所分泌的毒液中分離出來的,一般由10~31個(gè)氨基酸殘基組成,含有2對或3對二硫鍵,目前已鑒定出了50多種芋螺毒素,根據(jù)其作用受體的不同,將其分為δ-CNTX、μ-CNTX、α-CNTX以及ω-CNTX等多種類型,其中δ-CNTX特異性作用于神經(jīng)元電壓依賴性Na+通道,延緩Na+流失活速度,延長動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間;而μ-CNTX的作用機(jī)制與麻痹性貝毒(PSP)和河豚毒素(TTX)相似,能與是Na+通道位點(diǎn)1特異性結(jié)合,阻斷Na+內(nèi)流,抑制動(dòng)作電位的產(chǎn)生;α-CNTX特異性阻斷突觸后膜乙酰膽堿受體;ω-CNTX特異性阻斷神經(jīng)元電壓敏感性鈣離子通道,包括N、P、Q及L等不同亞型。芋螺毒素具有豐富的藥理學(xué)活性,在開放新藥方面有很好應(yīng)用前景。4展離子通道類毒素的檢測離子通道類毒素不論在數(shù)量上還是在毒性上,對人類的危害都很大,所以發(fā)展離子通道類毒素的檢測方法也是非常必要的。自上世紀(jì)80年代以來,國內(nèi)外研究者對于離子通道類毒素檢測技術(shù)的研究取得了很大的進(jìn)步,從生物、物理、化學(xué)、生理學(xué)和毒理學(xué)等角度出發(fā),開發(fā)出了一系列新的毒素檢測技術(shù)。4.2高效液相色譜分析隨著分析化學(xué)和工程技術(shù)的進(jìn)步,一些化學(xué)分析方法的建立和精密儀器的出現(xiàn),使得一些如酸堿滴定熒光測定法,薄層色譜法、氣相色譜法、毛細(xì)管電泳法、液相色譜熒光法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、X-射線結(jié)晶分析和核磁共振等物理化學(xué)方法得到迅速發(fā)展,其中高效液相色譜(HPLC)分析是一種已被廣泛應(yīng)用的經(jīng)典方法,已被許多國家定為國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法,但此檢測技術(shù)需要標(biāo)準(zhǔn)毒素,而目前多數(shù)毒素都缺乏標(biāo)準(zhǔn)品,這就限制了HPLC的應(yīng)用。而液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)在沒有標(biāo)準(zhǔn)毒素的情況下,只要知道這種毒素的分子量,就可對其進(jìn)行定性定量分析,且檢測靈敏度可達(dá)到ppt級(jí)水平4.3在免疫檢測方面的應(yīng)用免疫學(xué)檢測技術(shù)是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理,來定性定量檢測毒素的方法。由早期的多克隆抗體技術(shù)、單克隆抗體技術(shù),到現(xiàn)在的酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、競爭性酶免疫分析(EIA)等免疫學(xué)方法迅速發(fā)展起來。其中,90年代初由Cembella提出的ELISA法,因其靈敏性要比相應(yīng)的小鼠生物法和HPLC法高、檢出限低、需要的樣品量少、專一性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),得到了廣泛的使用,并開發(fā)出了商品化的檢測試劑盒。另外,在進(jìn)行免疫學(xué)檢測的同時(shí)也可使用物理化學(xué)的方法,以獲得更準(zhǔn)確可靠的結(jié)果,如有人利用免疫流式細(xì)胞儀技術(shù)加上高特異的PcAb,對原甲藻屬Prorocentru進(jìn)行了免疫遺傳分析,找到了在形態(tài)學(xué)上與其相近似的種。免疫學(xué)技術(shù)在海洋生物毒素的檢測領(lǐng)域中顯示出了明顯的優(yōu)勢,適用于現(xiàn)場的快速檢測,但由于此方法在很大程度上只能檢測出樣品中某些毒素成分的含量,不能反應(yīng)出樣品中真實(shí)的毒素情況,而且由于出現(xiàn)交叉反應(yīng),使其假陽性很高,因此,這項(xiàng)技術(shù)還有待于進(jìn)一步的完善與發(fā)展。4.4體外毒素檢測而根據(jù)離子通道類毒素可以專一性地作用于細(xì)胞膜離子通道的特點(diǎn)建立起來的細(xì)胞毒性檢測技術(shù),可以快速敏感的檢測毒素,是一項(xiàng)十分有前景的檢測技術(shù)。它是利用毒素對細(xì)胞的毒性作用來檢測毒素存在與否以及毒性大小的一種技術(shù),可以直接體現(xiàn)所測樣品的毒性狀況,同時(shí),細(xì)胞具有形態(tài)學(xué)和功能學(xué)上的均一性,實(shí)驗(yàn)條件易于控制。而對于鈉離子通道類毒素,可以專一性的作用于Na+通道受體,如麻痹性貝毒(PSP)可以作用于Na+通道的1位點(diǎn),阻斷Na+內(nèi)流,當(dāng)在培養(yǎng)的細(xì)胞中加入Na+通道活化劑藜蘆定或Na+/K+-ATP酶抑制劑烏本苷,細(xì)胞會(huì)由于Na+內(nèi)流過多而造成腫脹,甚至死亡,但如果同時(shí)加入具Na+通道阻斷作用的毒素PSP,Na+內(nèi)流會(huì)因拮抗作用而受到限制,使得細(xì)胞成活,由此可以確定毒素的存在,并根據(jù)細(xì)胞的成活率對毒素進(jìn)行定量分析。細(xì)胞毒性檢測技術(shù)雖然無法對毒素含量及組成精確定性,但是此方法可以直接體現(xiàn)毒素毒性大小,具有靈敏度高、省時(shí)、檢出限低,同時(shí)檢測所需的毒素標(biāo)準(zhǔn)品較微量,能同時(shí)檢測多個(gè)樣品等優(yōu)點(diǎn),使得該檢測技術(shù)得到普及開展和應(yīng)用的可能。近年來,TcllettBioteckLtd公司利用抑制劑與激動(dòng)劑對神經(jīng)細(xì)胞Na+通道競爭性作用的原理,設(shè)計(jì)出了一種用于PSP檢測的MISTTM裝置,其最低檢出限(2μg/100g鮮組織)約為小鼠生物法的20倍。而我們擬在現(xiàn)有的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上,優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件,結(jié)合鈉離子熒光探針CoroNaTMGreen標(biāo)記