影響重樓組織培養(yǎng)的因素研究

PAGEPAGEII影響重樓組織培養(yǎng)的因素研究摘要：目前，因為野生重樓的繁殖率太低，被過度的采挖以及環(huán)境污染所造成的影響等因素，導致其市場供應量也是難以達到大家的需求，并且緊隨重樓藥材需要的數(shù)量越來越大，致使野生重樓已經(jīng)形成了產(chǎn)生嚴重的資源危機。若能夠經(jīng)由組織培養(yǎng)而得到更多的重樓種苗，就能夠?qū)Υ穗y題予以有效解決。通過相關研究得出，重樓無性繁殖的一個最大難題就是組織培養(yǎng)技術，故而，研究人員可以在這方面予以進一步的探究，以期為重樓的發(fā)展和應用開拓出更加廣闊的前景。這篇文章主要探討了獨腳蓮重樓的組織培養(yǎng)工作，并對其采用組織培養(yǎng)的重要技術進行了分析，從而希望為重樓屬的相關植物能夠迅速繁殖提供更多的和具有參考價值的資料。由于重樓有著非常大的藥用及經(jīng)濟價值，希望經(jīng)過探究去尋找到讓重樓迅速繁殖的方式，有效去緩解重樓自然產(chǎn)量嚴重缺乏的現(xiàn)狀，最終實現(xiàn)重樓資源能夠可持續(xù)性使用的目標。關鍵詞：重樓組織；培養(yǎng)策略；影響因素；獨腳蓮重樓

目錄125291前言 1188802材料與方法 295532.1材料 296792.2方法 269602.2.1外植體處理方式和消毒時間的篩選 213222.2.2不同激素配比對愈傷組織增殖的影響 273852.3實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計 2310162.4數(shù)據(jù)處理 3198573結(jié)果 3230473.1外植體不同處理方式和消毒時間的篩選 316713.2獨腳蓮重樓愈傷組織的增殖研究 4323974討論 61113參考文獻 613842致謝 9PAGE91前言重樓（）是延齡草科重樓屬，是多年生直立草本，還被叫做七葉一枝花，多生長在山坡林下陰涼位置或者是溝邊草叢的陰濕位置。這種植物在藥用功效方面包括了清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚、抗腫瘤、止血以及免疫調(diào)節(jié)等，常常被用在痛腫、毒蛇咬傷以及驚風抽搐等多種病癥的治療中劉銀花，王躍華，何新友，陳燕，唐旭，梅英，黃鵬.重樓愈傷組織的抑菌作用研究[J].成都大學學報（自然科學版），2015，01：12-15.。最近幾年，重樓資源的需求數(shù)量也在一年比一年的增多，再加上主要的生產(chǎn)區(qū)具有著亂采濫挖以及輕視資源保護的現(xiàn)象，也導致了野生資源被嚴重的破壞，在供需矛盾方面也是凸顯的，使此類資源也面臨了枯竭的威脅［2～3］。重樓的種子存在著“二次休眠”的特征，處于自然環(huán)境下要經(jīng)過兩個冬天才可以發(fā)芽成苗，也就是說，如果根據(jù)它的自然狀態(tài)去實施種植的話，不僅會在出苗方面比較慢，并且在出苗率上也是比較低的。另外，重樓的發(fā)育過程非常慢，從種子萌發(fā)開始算，到能夠開花結(jié)實時往往要超過4～5年的時間，它的幼年期后需要4年左右。因此說，對于重樓采用組織培養(yǎng)技術的探究就成為了有效加快重樓無性繁育的一個重要渠道，也存在著非常大的現(xiàn)實意義李恒，蘇豹，張兆云，楊宇明.中國重樓資源現(xiàn)狀評價及其種植業(yè)的發(fā)展對策[J].西部林業(yè)科學，2015，03：1-7+15.。劉銀花，王躍華，何新友，陳燕，唐旭，梅英，黃鵬.重樓愈傷組織的抑菌作用研究[J].成都大學學報（自然科學版），2015，01：12-15.李恒，蘇豹，張兆云，楊宇明.中國重樓資源現(xiàn)狀評價及其種植業(yè)的發(fā)展對策[J].西部林業(yè)科學，2015，03：1-7+15.在中國對于重樓的藥材使用量比較大，在云南白藥及抗病毒顆粒等多種中成藥中均使用了此種藥材，并且是比較重要的原料藥之一，因此說在市場需要數(shù)量方面也是非常大的。緊隨最近幾年的藥用范圍持續(xù)擴大，當前所具有的藥源已經(jīng)無法保證市場的需要，進而導致其價格也是持續(xù)的升高，在20世紀的80年代，其價格大概是2.5元/，而最近幾年的價格竟達到了300元/，從它的價格上也能夠看出，現(xiàn)如今的重樓資源是比較缺乏，在供需矛盾方面是非常明顯的。故而，用人工的方式實施重樓的迅速繁殖，有效加快重樓根莖的增長速度，并且規(guī)劃性的去發(fā)展可持續(xù)是種植業(yè)，就成為了保障此種藥材合理供應的唯一途徑。2材料與方法2.1材料在本文中，主要是將獨腳蓮重樓的芽進行多種方式的處理，然后來作為外植體，進而探究在消毒時間及激素配比等方面對于其繁殖過程具有著怎樣的影響。在此次實驗中完成了獨腳蓮重樓愈傷組織的誘導過程，以及迅速繁殖的過程，并且為同一屬的其它植物在生物技術方面的探究奠定了良好的基礎。2.2方法2.2.1外植體處理方式和消毒時間的篩選選擇生長狀態(tài)比較好的獨腳蓮重樓根莖，在清水洗凈后放在消清靈液（0.5）中進行10的浸泡，然后再用流水予以沖洗兩次，將洗凈的外植體放于陰涼位置予以晾干，置于超凈臺之上，首先使用酒精消毒（70），時間為30s，再用0.1的升汞分別進行4、8、12以及16的處理，處理好以后使用無菌水進行四次沖洗，最后使用無菌濾紙將其表面水分吸干。選擇獨腳蓮重樓根莖上的芽體，其直徑應該大于0.5，在處理方法上分為兩種：剝?nèi)パ壳省⒉粍內(nèi)パ壳?。然后把消毒以后的芽外植體接種在MS+1.0+IAA1.0的培養(yǎng)基之上，對于兩種處理方法各接種15瓶，每個瓶還要接種兩個外植體劉銀花，王躍華，唐旭，陳燕，黃鵬，梅英.華重樓植株的快速繁殖研究[J].中草藥，2015，19：2925-2931.。劉銀花，王躍華，唐旭，陳燕，黃鵬，梅英.華重樓植株的快速繁殖研究[J].中草藥，2015，19：2925-2931.2.2.2不同激素配比對愈傷組織增殖的影響選擇生長狀態(tài)比較好，并且顏色呈現(xiàn)黃白色的獨腳蓮重樓愈傷組織，然后轉(zhuǎn)接至已經(jīng)加入了細胞分裂素（，0.5）和生長素（，0.3~2）的四種愈傷組織繁殖培養(yǎng)基中（標號），進行60d培養(yǎng)之后去對愈傷組織的繁殖狀況予以觀察和統(tǒng)計。2.3實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計在實驗的相關數(shù)據(jù)統(tǒng)計方面主要包括了污染率（污染外植體的數(shù)量和總接種數(shù)量的比值）、啟動率（最終獲得啟動的外植體數(shù)量和總接種數(shù)量的比值）、誘導率（形成愈傷組織的外植體數(shù)量和總接種數(shù)量的比值）以及愈傷組織繁殖倍數(shù)（最終收獲的重量和接種時的重量形成的比值）熊海浪，于振艷，張宗申，劉同祥，葉乾堂.影響瀕危藥用植物滇重樓愈傷組織發(fā)生的因素[J].時珍國醫(yī)國藥，2012，06：1372-1374.。熊海浪，于振艷，張宗申，劉同祥，葉乾堂.影響瀕危藥用植物滇重樓愈傷組織發(fā)生的因素[J].時珍國醫(yī)國藥，2012，06：1372-1374.2.4數(shù)據(jù)處理對于數(shù)據(jù)計算結(jié)果給予的表示采用，使用統(tǒng)計學軟件去實施方差剖析，使用了新復極差（）的方式去實施多重對比；當代表差異比較明顯，當代表差異十分的明顯。3結(jié)果3.1外植體不同處理方式和消毒時間的篩選把兩種處理方式的芽外植體采用不一樣的消毒時間處理之后接種在MS+1.0+IAA1.0培養(yǎng)基之上，然后進行30d培養(yǎng)，最總的實驗結(jié)果統(tǒng)計情況如表1。在這一數(shù)據(jù)統(tǒng)計中，將芽體積出現(xiàn)膨大當做“啟動外植體”。從上表1的相關數(shù)據(jù)能夠得出，不同的處理方法和不同的消毒時間均能夠?qū)τ讵毮_蓮重樓外植體的結(jié)果造成影響，致使其染菌率以及啟動率有著不同程度的差異。對于實驗的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析后得出，緊隨升汞消毒的時間自4延長至16時，在染菌率及啟動率的變化上也呈現(xiàn)出來慢慢減少的態(tài)勢，特別是采用了去芽鞘處理的外植體更加顯著王躍華，陳燕，張玨，張紅玉，游亞莉，田孟良.華重樓愈傷組織培養(yǎng)及薯蕷皂苷含量測定[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2014，08：1936-1940.。另外，消毒時間相同時，經(jīng)由去芽鞘處理的外植體在染菌率方面要更低一些，而未經(jīng)去芽鞘處理的芽在消毒12和16時的染菌率并未出現(xiàn)明顯的變化，但是，其它各組的對比則有著十分明顯的差異（）；對于啟動率方面，經(jīng)由去芽鞘處理的外植體在實施低于12消毒時，在啟動率上均要比未采用去芽鞘處理的外植體更高，然而，在消毒時間延長至16時，則經(jīng)由去芽鞘處理的外植體在啟動率上又有著突然減少的變化（38.63±2.98），明顯的要比未采用去芽鞘處理的啟動率（55.85±1.07）低很多何明生，李秀.重樓藥理作用的研究進展[J].世界中醫(yī)藥，2012，06：579-582.。王躍華，陳燕，張玨，張紅玉，游亞莉，田孟良.華重樓愈傷組織培養(yǎng)及薯蕷皂苷含量測定[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2014，08：1936-1940.何明生，李秀.重樓藥理作用的研究進展[J].世界中醫(yī)藥，2012，06：579-582.在實驗中還發(fā)現(xiàn)，在升汞消毒的時間延長至16的時侯，大部分經(jīng)由去芽鞘處理的外植體變成了灰色，即汞中毒現(xiàn)象。故而，綜合實驗結(jié)果得出，經(jīng)由去芽鞘處理的外植體在升汞消毒時間上最好是8，以此為前提，則外植體在污染率方面是（11.97±0.91），是比較低的一個狀態(tài)，而在啟動率方面則為（84.82±2.59），處于一個比較好的情況；對于未采用去芽鞘處理外植體則選擇的消毒時間是12，此時的污染率是（12.26±0.98）和啟動率是（71.62±1.17）谷海燕.藥用植物華重樓的資源現(xiàn)狀及其繁育研究進展[J].四川林業(yè)科技，2014，04：56-59.。谷海燕.藥用植物華重樓的資源現(xiàn)狀及其繁育研究進展[J].四川林業(yè)科技，2014，04：56-59.3.2獨腳蓮重樓愈傷組織的增殖研究選擇生長態(tài)勢比較好的愈傷組織，放在超凈臺上把其芽體切除，合理切割處理后轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)中，而培養(yǎng)基方面則分為與不同激素配比而成的號MS培養(yǎng)基，實施60d的培養(yǎng)之后，去對愈傷組織的繁殖狀況實施觀察和統(tǒng)計，相關數(shù)據(jù)在下表3中展示。通過上表3能夠得出，在濃度是0.5的時侯，緊隨濃度的增加至1.0時，在繁殖倍數(shù)上是顯著提高的，然而在增加到2.0時，則繁殖倍數(shù)出現(xiàn)了下降表現(xiàn)，這就反映出生長素對于黒籽重樓愈傷組織的繁殖能力具有著顯著的正面影響，但是在濃度過高的時候，反而會產(chǎn)生負面的影響劉佳，楊亞利，張鵬，宋發(fā)軍，孟艷艷.4種重樓不同部位4種重樓皂苷含量的分析[J].中國實驗方劑學雜志，2016，16：44-48.。在對于各種繁殖培養(yǎng)基上的愈傷組織生長狀況進行觀察后得出，在B1培養(yǎng)基上的愈傷組織呈現(xiàn)出了淺黃色，其質(zhì)地也較為疏松一些；B2與B3呈現(xiàn)出黃白色和緊密的質(zhì)地；B4則出現(xiàn)了褐化情況，并且出現(xiàn)了很多不定根。然后在對表3中的B3培養(yǎng)基相關數(shù)據(jù)進行分析，在濃度是1.0的時侯，形成的繁殖倍數(shù)是最高的（2.38±0.11）倍。故而，最終能夠得出在B3培養(yǎng)基MS+0.5+1.0最適合愈傷組織進行增殖。劉佳，楊亞利，張鵬，宋發(fā)軍，孟艷艷.4種重樓不同部位4種重樓皂苷含量的分析[J].中國實驗方劑學雜志，2016，16：44-48.

4討論因為重樓所具有的藥用價值比較高，而且市場上又出現(xiàn)了供不應求的情況，所以說，應該對其人工栽培以及無性增殖技術予以探究和提高。時至今日，對于重樓屬所實施的組織培養(yǎng)探究還沒有獲得較好的成效，導致此種情況出現(xiàn)的原因比較多，比如說此類植物自身細胞脫分化能力不高，以及當前的研究還為深入等。在此次實驗中，主要是應用獨腳蓮重樓的芽當做外植體，并通過合理的消毒與合適的培養(yǎng)基培養(yǎng)后誘導出了愈傷組織，這和我國的李群等一些研究人員的研究情況是比較相近的楊麗云，陳翠，呂麗芬，袁理春.云南重樓的組織培養(yǎng)與植株再生[J].植物生理學通訊，2008，05：947-948.。另外，此次還成功的完成了迅速增殖獨腳蓮重樓愈傷組織的新型培養(yǎng)技術，成為了進一步探究的重要參考資料。楊麗云，陳翠，呂麗芬，袁理春.云南重樓的組織培養(yǎng)與植株再生[J].植物生理學通訊，2008，05：947-948.目前，在重樓的無性繁殖以及產(chǎn)業(yè)化種植等相關技術方面還沒有獲得理想的成果，雖說在根莖切塊及種子兩種繁殖技術上已經(jīng)逐漸成熟，然而在組織培養(yǎng)和更加規(guī)范化的人工栽培等技術方面還需要不斷的探究和提高。最近幾年，我國和其他國家的研究者均開始重視了對重樓藥用價值的探究，并且也獲得了一些不錯的實驗結(jié)論，比如說在重樓的抗癌作用上的研究等，故而，對其藥理功效實施深入的探究是具有著極大現(xiàn)實意義的，能夠讓重樓的臨床應用價值再次提高。參考文獻[1]劉銀花，王躍華，何新友，陳燕，唐旭，梅英，黃鵬.重樓愈傷組織的抑菌作用研究[J].成都大學學報（自然科學版），2015，01：12-15.[2]李恒，蘇豹，張兆云，楊宇明.中國重樓資源現(xiàn)狀評價及其種植業(yè)的發(fā)展對策[J].西部林業(yè)科學，2015，03：1-7+15.[3]劉銀花，王躍華，彭世明，唐旭，陳燕，何新友.華重樓體細胞胚誘導研究[J].中藥材，2015，07：1355-1357.[4]劉銀花，王躍華，唐旭，陳燕，黃鵬，梅英.華重樓植株的快速繁殖研究[J].中草藥，2015，19：2925-2931.[5]熊海浪，于振艷，張宗申，劉同祥，葉乾堂.影響瀕危藥用植物滇重樓愈傷組織發(fā)生的因素[J].時珍國醫(yī)國藥，2012，06：1372-1374.[6]何明生，李秀.重樓藥理作用的研究進展[J].世界中醫(yī)藥，2012，06：579-582.[7]王躍華，陳燕，張玨，張紅玉，游亞莉，田孟良.華重樓愈傷組織培養(yǎng)及薯蕷皂苷含量測定[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2014，08：1936-1940.[8]谷海燕.藥用植物華重樓的資源現(xiàn)狀及其繁育研究進展[J].四川林業(yè)科技，2014，04：56-59.[9]羅敏，李娟，章文偉，鄧才富，譚秋生.重樓種苗繁育研究進展[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2016，01：120-124.[10]楊光義，胡培，葉方.重樓資源分布與可持續(xù)利用研究進展[J].中國藥師，2016，