豬藍(lán)耳病抗體及豬偽狂犬病抗體ELISA檢測(cè)方法

目錄TOC\o"1-3"\h\u1材料與方法 31.1材料 31.1.1主要試劑 31.1.2主要儀器 31.2發(fā)病情況 41.3病理剖檢 41.4細(xì)菌學(xué)檢測(cè) 41.5血清學(xué)檢測(cè) 41.5.1豬瘟抗體ELISA檢測(cè)方法 41.5.2豬藍(lán)耳病抗體及豬偽狂犬病抗體ELISA檢測(cè)方法 51.6病原檢測(cè) 61.6.1DNA的提取 61.6.2RNA的提取步驟 61.6.3PCR檢測(cè) 62結(jié)果與分析 72.1病理變化 72.2細(xì)菌學(xué)檢測(cè)結(jié)果 72.3血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果 72.4病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果 82.5治療措施及轉(zhuǎn)歸情況 83討論與分析 9致謝 10參考文獻(xiàn) 10摘要本文重點(diǎn)介紹了典型的豬瘟和高致病性藍(lán)耳病混合物診斷和治療。這是江蘇省某大型養(yǎng)豬場(chǎng)，那里的仔豬和保育豬呼吸急促，腹部發(fā)紅，情緒低落，進(jìn)食，腹瀉，嘔吐。從發(fā)病到5天內(nèi)死亡。在死亡之前，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，臨床觀察和實(shí)驗(yàn)室檢查，神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，呼吸困難和高燒仍然是該疾病的特征，并被診斷為豬瘟和藍(lán)耳病的高致病性。綜合治療和預(yù)防措施取得了良好的效果。該混合物為豬瘟和高致病性藍(lán)耳病豬的混合感染提供了一種診斷和治療方法。關(guān)鍵詞：高致病性藍(lán)耳病豬瘟混合感染診治仔豬隨著中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的飛速發(fā)展和畜禽的頻繁分布，越來(lái)越多的豬疾病和復(fù)雜疾病變得越來(lái)越難以控制。中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的健康生產(chǎn)正受到巨大威脅。特別是在零售農(nóng)場(chǎng)和中小型養(yǎng)豬場(chǎng)的情況下，豬病影響下的生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效益已大大受損，大型養(yǎng)豬場(chǎng)也遭受了疾病和壓力。藍(lán)耳病通常被稱為豬生殖和呼吸綜合癥。高致病性耳部疾病是由病毒突變引起的急性和難治性傳染病。根據(jù)楊曉華等人的研究，仔豬的發(fā)病率為100％，死亡率超過(guò)50％，母豬的流產(chǎn)率超過(guò)30％，肥豬也將死去，這造成了仔豬死亡。嚴(yán)重威脅豬的健康。養(yǎng)豬業(yè)。PRRSV感染還會(huì)誘導(dǎo)豬的免疫抑制，從而降低免疫系統(tǒng)功能。一些突發(fā)性因素可能導(dǎo)致繼發(fā)感染和混合感染，因此豬病的臨床癥狀變得更加復(fù)雜，難以診斷和預(yù)防。天科分公司認(rèn)為，中國(guó)大多數(shù)養(yǎng)豬場(chǎng)都是熟悉的養(yǎng)豬場(chǎng)，給中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，藍(lán)耳病的防治仍是中國(guó)的熱點(diǎn)。最近的預(yù)防和控制。在中國(guó)豬病的發(fā)生中，在生產(chǎn)過(guò)程中防止藍(lán)耳病的發(fā)生和傳播非常重要。經(jīng)典豬瘟與高致病性耳部疾病的結(jié)合是一種常見(jiàn)的臨床現(xiàn)象。中國(guó)許多養(yǎng)豬戶都感染了這兩種病原體，據(jù)報(bào)道有數(shù)十種疾病。據(jù)王永波等人。2011年，我們?cè)?02個(gè)大型養(yǎng)豬場(chǎng)中測(cè)試了豬瘟，豬耳病和原始狂犬病，并在31個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)中發(fā)現(xiàn)了31個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)和清耳養(yǎng)豬場(chǎng)。農(nóng)田占30.4％，而經(jīng)典豬瘟和耳病占15.44％。結(jié)果表明，中國(guó)古典豬瘟和耳病也在增加。面對(duì)如此嚴(yán)重的情況，快速診斷和準(zhǔn)確治療經(jīng)典豬瘟和耳部疾病的混合物非常重要，這是中國(guó)獸醫(yī)需要認(rèn)真研究的方向。本文介紹了江蘇省某大型養(yǎng)豬場(chǎng)的診治過(guò)程，為豬瘟及高致病性耳病的大規(guī)模綜合診治提供參考資料。1材料與方法1.1材料1.1.1主要試劑豬藍(lán)耳抗體ELISA檢測(cè)試劑盒，豬偽狂犬病ELISA檢測(cè)試劑盒，豬瘟抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自IDEXX。Trizol試劑，逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq酶分別購(gòu)自Introgen，Promega和TaKaRa。1.1.2主要儀器3K15高速冷凍離心機(jī)；7500實(shí)時(shí)定量PCR儀JS2380A自動(dòng)凝膠圖像分析儀；LDZM立式智能壓力蒸汽滅菌器JA2003電子秤；HG101-1電動(dòng)滾筒空氣干燥機(jī)；DK-8D電加熱室JN303-4電加熱培養(yǎng)箱QB296梯度PCR；HYQ-2121A渦旋混合器。1.2發(fā)病情況養(yǎng)豬場(chǎng)位于江蘇省南京市。目前，病原體周圍有450頭母豬（危機(jī)發(fā)生后21天）。泌乳和哺乳的豬呼吸困難，腹部和末端發(fā)紅，情緒低落，進(jìn)食困難。腹瀉，大多數(shù)嘔吐的豬在嘔吐的5天內(nèi)死亡。因神經(jīng)系統(tǒng)癥狀而死亡，例如高燒，呼吸急促，體重減輕。發(fā)病率為30％，死亡率接近55％。懷孕母豬的流產(chǎn)次數(shù)已大大增加。出生后60天，出生前30天和20天分別注射了藍(lán)色疫苗，豬瘟疫苗和豬偽狂犬病疫苗。1.3病理剖檢選擇3只具有典型癥狀的仔豬進(jìn)行病理切片并記錄結(jié)果。1.4細(xì)菌學(xué)檢測(cè)根據(jù)常規(guī)實(shí)驗(yàn)室方法收集紫色明膠，肺和腹股溝淋巴結(jié)。使用《獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)指南》中所述的染色方法檢查涂片。（1）涂層：清潔載玻片，在載玻片上滴一滴水，用有效的消毒劑吸收水滴花鍵的輕微損壞，然后在室溫下輕輕覆蓋載玻片以自然干燥。（2）染色：草酸銨結(jié)晶紫色染色液，約1-2分鐘。洗滌：將染料倒入無(wú)色的細(xì)水中，該細(xì)水從載玻片的頂部流出。（3）煤染料：染色1-3分鐘后，洗滌綠色液體。（4）脫水：將酒精脫水30秒至1分鐘，然后洗滌。（5）單色：用碳酸鹽洗滌紅色染料10-20秒（6）顯微鏡檢查：樣品完全干燥后，先用高低顯微鏡觀察，再用油鏡觀察。革蘭氏陽(yáng)性菌為紫色，革蘭氏陰性菌為紅色。1.5血清學(xué)檢測(cè)對(duì)于收集的22個(gè)血清樣品，使用酶免疫吸附測(cè)定（ELISA）檢測(cè)血清抗體，以檢測(cè)豬的免疫力（PRRS），耳聾（PRRS）和偽狂犬病（PR）。豬瘟抗體的檢測(cè)方法嚴(yán)格按照美國(guó)IDEXX公司的試劑盒手冊(cè)進(jìn)行，豬藍(lán)蟲(chóng)抗體和豬大鼠抗體的檢測(cè)方法嚴(yán)格按照武漢普瑞公司的方法進(jìn)行，動(dòng)物生物學(xué)試劑盒。1.5.1豬瘟抗體ELISA檢測(cè)方法（1）清洗液的制備：用去離子水作為清洗液，濃度為1333610。用適當(dāng)?shù)脑噭┖驮噭┖邢♂屆總€(gè)試劑盒和包裝中的試劑。（2）樣品稀釋：將稀釋的測(cè)試血清樣品以1:40的比例混合。（3）樣品反應(yīng)：將預(yù)先包裝的板放入用于豬瘟和手足口病的抗體檢測(cè)試劑盒中。每個(gè)母板都有兩個(gè)語(yǔ)音控制孔，一個(gè)用于陽(yáng)性和空白對(duì)照組，另一個(gè)用于樣品測(cè)試孔。將陰性對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組和空白對(duì)照組加入陰性對(duì)照組。在陽(yáng)性對(duì)照組中，每個(gè)樣品的稀釋度為100μl，并將樣品的測(cè)試孔加入到每個(gè)100μl孔的稀釋的血清樣品中。在37度下反應(yīng)30分鐘后，將孔中的液體搖動(dòng)，將板洗滌3次并干燥。（4）添加酶：除了清空對(duì)照組的孔外，每孔添加50孔以結(jié)合酶。37至30分鐘后，將液體從孔中移出。（5）顯色反應(yīng)：向每個(gè)孔中加入底部液體A50sL，然后添加并混合底部液體B50sL，并在室溫下于37℃在黑暗中混合10分鐘，持續(xù)10分鐘。（6）終止反應(yīng)：加50ml終止反應(yīng)。（7）酶標(biāo)記的結(jié)果：空白對(duì)照組為0，并且讀取酶的450nmod值。（8）結(jié)果：第一陰性對(duì)照組：陰性對(duì)照組為無(wú)色或淡黃色，而陽(yáng)性對(duì)照組明顯為黃色，表明該試驗(yàn)有效。結(jié)果所有平板陰性對(duì)照組均為無(wú)色，陽(yáng)性對(duì)照組為黃色，所有豬瘟抗體ELISA包裝均有效。有效測(cè)試孔的ODS值是對(duì)應(yīng)于語(yǔ)音的ODS值的平均值的2.1倍，并且被分類為正。如果語(yǔ)音對(duì)比度a的平均值小于0.08，則結(jié)果為0.08。1.5.2豬藍(lán)耳病抗體及豬偽狂犬病抗體ELISA檢測(cè)方法（1）清潔溶液的制備：取出一匙糖精濃縮液，恢復(fù)至室溫，加熱37至10分鐘，將溶解的鹽搖勻，并用去離子水稀釋20倍。稀釋每個(gè)試劑盒的試劑，并同時(shí)標(biāo)記相應(yīng)的試劑和試劑盒。（2）樣品稀釋度：以1:40的稀釋度測(cè)試血清并以1：4的稀釋度用作陽(yáng)性和陰性對(duì)照。（3）樣品反應(yīng)：去除PRRSV和PRV測(cè)試樣品后2分鐘，使用兩塊帶有稀釋清潔液（200sl孔）的清潔板，然后在干凈的吸收板上干燥。將100sL的稀釋樣品添加至測(cè)試板。在陰性和陽(yáng)性對(duì)照組中均安裝了兩個(gè)孔。每口井為100sL。輕輕按壓樣品中的孔，以在37攝氏度下孵育30分鐘。將溶液搖入平板的孔中，用200sL/孔的清潔溶液緩慢離開(kāi)平板3分鐘，然后在干凈的絲錐上輕拍并干燥吸收性片材。（4）添加酶反應(yīng)：將100升山羊抗豬標(biāo)準(zhǔn)酶抗體放入每個(gè)孔中，將溫度設(shè)置為37攝氏度30分鐘，然后洗滌5次。（5）顯色反應(yīng)：向每個(gè)孔中加入底部液體A50sL，然后添加底部液體B50sL，并在室溫下放置10分鐘而不會(huì)混合。（6）反應(yīng)終止：每孔在10分鐘內(nèi)測(cè)量50ml終止溶液的結(jié)果。（7）酶聯(lián)試驗(yàn)結(jié)果顯示空白為0，酶標(biāo)性腹膜炎的od值為630nm。（8）PRRS結(jié)果證實(shí)，陽(yáng)性對(duì)照孔的平均OD630值大于或等于1.0，并且陰性對(duì)照孔的平均OD630值必須小于0.3。樣品的OD630值大于0.42，為正。OD630值在0.38和0.42之間的示例被視為可疑。采樣的OD630值小于0.38，該值為負(fù)。（9）PR結(jié)果確認(rèn)正極控制孔OD630的測(cè)試條件值為0.8，負(fù)極控制孔OD630的平均值必須小于0.3。如果樣品孔的OD630值大于0.33，則為正。如果樣品孔的OD630值小于0.30，則判定為負(fù)。OD630值在0.30到0.33之間的樣品井被認(rèn)為是可疑的。1.6病原檢測(cè)1.6.1DNA的提取從三頭豬中收集豬肺，腹股溝淋巴結(jié)和脾臟，并與相同的基因混合，然后使用ThaiNettal系列ThaiTai注射柱ANIMALDNAOUT提取試劑盒提取DNA。取陰性樣品sl和400sl均勻液體，加入12.5L蛋白酶K和50L10％SDS溶液，混合并在56攝氏度下反應(yīng)30分鐘；在4°C室溫下放置10分鐘；12000離心10分鐘;丟棄加入1000升乙醇的75％，以洗滌1000升乙醇；在4°C下離心7500分鐘，靜置5分鐘；將溶解在污水中的15種沉淀物溶解10分鐘，作為PCR擴(kuò)增的模板。1.6.2RNA的提取步驟將豬的肺，腹股溝淋巴結(jié)和脾臟與三只豬的基因混合，然后使用天網(wǎng)沙系列RNA提取試劑盒提取RNA。而已：（1）從陰性對(duì)照組中取出200升血清加入1mL曲安西龍-A，并在劇烈搖動(dòng)后徹底混合。（2）在室溫下放置5分鐘以完全分離核酸化合物。（3）加入200sl氯仿混合物，用手指提起渦旋壁雜質(zhì)并冷卻5分鐘。在4°C到12000r/min下離心10分鐘（液體現(xiàn)在分為3層）。（4）取下頂部進(jìn)行清潔，添加等量的異丙醇，并充分混合。（5）在室溫下儲(chǔ)存15-20°C或-20°C（過(guò)夜）以沉淀RNA。在4°C至12,000r/min的轉(zhuǎn)速下，離心力在10分鐘后澄清。（6）將75％的無(wú)水乙醇放入1毫升中，并沖洗一次。在4°C和7600-8000r/min下離心5分鐘。（7）拆下上部清潔劑，注意不要吸入沉淀物。超級(jí)網(wǎng)民干燥旅行15-20分鐘。（8）溶于DEPC水（15sL），置于4°C以下。1.6.3PCR檢測(cè)根據(jù)GenBank登錄的CSFV，PRRSV-N基因和PRVgE核苷酸序列，由上海英駿生物合成的Primer5.0軟件設(shè)計(jì)的PCR引物，其他PCR參數(shù)如表1所示。表1PCR分析引物序列及循環(huán)參數(shù)基因Genes引物序列Primersequence(5′-3′)片段大小Fragmentsize/bp退火溫度Annealinetemperature/℃延生時(shí)間（S）循環(huán)圈數(shù)CyclesCSFVF:5`GTCACAGCACTTAATGTGGTC3` R:5`CACTTACCTATGGGGTAGTGTG3`512566030PRRSVF:AGCAGGATCCATGCCAAGTAACAACGGCAAGCAGR:TAACCTCGAGTCATGCTGAGGGTGATGCTGTG372636030PRVgEF:CCCTGGACGCGAACGGCACGATGR:GGGTGGCACGCGGTCTCGAAGCA850686035擴(kuò)增完后1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。2結(jié)果與分析2.1病理變化剖宮產(chǎn)的三只失敗的豬的主要病理變化是：肺水腫，間質(zhì)性和出血性肺炎以及心臟積液。腸壁變薄，腹股溝淋巴結(jié)在膜下出血，腎臟變灰和浮腫。2.2細(xì)菌學(xué)檢測(cè)結(jié)果無(wú)菌采集3只患病豬的腹水，肝，脾，肺，腎，腹股溝淋巴結(jié)和革蘭氏染色，并在顯微鏡下放大400倍。2.3血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果使用IDEXX抗體測(cè)試試劑盒，從雌性和雄性豬以及一組患病豬中收集了三只仔豬，并收集了血清。豬基于豬瘟，豬藍(lán)耳病毒抗體以及豬偽狂犬病GI和GB抗體。測(cè)試結(jié)果列于表2。表2顯示，經(jīng)典豬瘟的抗體陽(yáng)性率低至44.4％，經(jīng)典豬瘟的抗體陽(yáng)性率為66.7％。豬藍(lán)色病毒抗體疫苗接種的陽(yáng)性率為100％，但豬抗體的陽(yáng)性率為0，幾乎沒(méi)有保護(hù)作用。豬中野生毒素（GI）抗體的陽(yáng)性率為100％，疫苗抗體（GB）為100％，表明該豬場(chǎng)未感染豬偽狂犬病病毒。表2血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果母豬公豬發(fā)病仔豬陽(yáng)性數(shù)陽(yáng)性率陽(yáng)性數(shù)陽(yáng)性率陽(yáng)性數(shù)陽(yáng)性率豬瘟抗體8/1844.4%2/2100%2/366.7%豬藍(lán)耳病病毒抗體18/18100%2/2100%0/30豬偽狂犬GI抗體0/1800/200/30豬偽狂犬GB抗體18/18100%2/2100%3/3100%A/B：陽(yáng)性數(shù)/檢測(cè)數(shù)2.4病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果豬偽狂犬病毒、豬瘟病毒和豬藍(lán)耳病毒的PCR或RT-PCR結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。圖1豬瘟病毒RT-PCR檢測(cè)結(jié)果圖2豬藍(lán)耳病病毒RT-PCR檢測(cè)結(jié)果M:marker;1-3:樣品;+:陽(yáng)性對(duì)照;—:陰性對(duì)照Fig1ElectrophoresisresultsofCSFVRT-PCRproductsM:marker;1-3:samples;+:positivecontrol;-:negativecontrolM:marker;1-3:樣品;+:陽(yáng)性對(duì)照;—:陰性對(duì)照Fig2ElectrophoresisresultsofPRRSVRT-PCRproductM:marker;1-3:samples;+:positivecontrol;-:negativecontrol2.5治療措施及轉(zhuǎn)歸情況根據(jù)豬場(chǎng)的臨床癥狀，并根據(jù)剖宮產(chǎn)的病理狀況，實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果和免疫程序，可以確定這種狀況是經(jīng)典豬瘟和耳部感染的混合體，制定以下治療方案。（1）無(wú)害化處理：將豬深挖，在坑坑和地面撒上生石灰，情況嚴(yán)重。（2）隔離消毒：對(duì)疾病苗圃進(jìn)行封閉管理。農(nóng)場(chǎng)的各個(gè)階段均用1：500的碘化乙烯氣霧劑消毒，使用3％的腐蝕性溶液消毒下水道和糞便，并使用3％的腐蝕性氣霧劑對(duì)農(nóng)場(chǎng)的外部環(huán)境進(jìn)行消毒。消毒。頭7天每?jī)商煜疽淮危恢?天后每?jī)商煜疽淮?，谷倉(cāng)外的頭7天每三天消毒一次，每七天消毒一次。（3）緊急接種脾臟疫苗：具體計(jì)劃是向所有母豬和公豬注入4塊肌肉。向70歲的仔豬注射1.5塊肌肉。仔豬兩塊肌肉70天；自由。豬瘟疫苗已在10天內(nèi)免疫。（4）活疫苗用于仔豬的緊急免疫。豬瘟疫苗接種后的第一周，對(duì)14歲以下的仔豬在14天之內(nèi)給予一只肌肉，在56日給予56只肌肉。在14天之內(nèi)兩次注射56歲的仔豬。母豬在出生后7天內(nèi)放棄一次。（5）綜合治療：每噸生姜多糖1000g，多維強(qiáng)化甲毒素1000g，電解150g，電解1000g，電解7天。通過(guò)這些措施，兩種疫苗都是完全免疫的，疾病得到了控制。3討論與分析初步診斷出上述發(fā)病率，臨床癥狀為典型的豬瘟與高致病性藍(lán)耳病。目前，豬的疾病和混合感染病例多種多樣，表現(xiàn)出各種匯率，病原體癥狀和病理變異性。因此，混合感染的診斷應(yīng)與流行病學(xué)調(diào)查，臨床診斷和治療密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)室的快速檢測(cè)可以使診斷符合客觀現(xiàn)實(shí)，為疾病的預(yù)防和控制提供科學(xué)依據(jù)。專家為混合感染病例的診斷和治療提供正確的治療方法。治療經(jīng)典豬瘟，消除豬的耳部疾病，經(jīng)典豬瘟主要在飼料和水中傳播，使用防腐劑和黃疸多糖改善免疫力并減輕豬的壓力。注射液“復(fù)合黃疸多糖”注射液混合抗豬瘟高游離血清感染豬瘟和藍(lán)耳病158例，治愈122例，治愈率為70.9％。盡管有其他方法，但綜合預(yù)防和控制措施不僅在疫苗接種和藥物治療方面，而且在免疫合理性方面都是普遍目標(biāo)。據(jù)劉仁輝等人介紹，高致病性豬耳聾滅活疫苗首次具有免疫力，增強(qiáng)了免疫力，抗體保護(hù)率僅為30％-40％。高致病性鯖魚(yú)耐火疫苗或生物疫苗的使用可以提高免疫力，抗體保護(hù)率可以達(dá)到80％以上，效率大大提高。此外，從養(yǎng)豬場(chǎng)中純化病原體對(duì)于環(huán)境健康管理和嚴(yán)格的繁殖管理更為重要。任何反向鏈接都將導(dǎo)致疾病和生產(chǎn)利潤(rùn)損失。根據(jù)國(guó)內(nèi)外報(bào)道，科技人員可以使用多種提取方法。王朝軍等報(bào)道，安全技術(shù)不能完全預(yù)防產(chǎn)婦疾病，但適合于商業(yè)化生豬的生產(chǎn)，可以減少疾病的危害并改善豬的健康。病原體的純化是大型養(yǎng)豬場(chǎng)最經(jīng)濟(jì)的疾病控制方法。主要方法是傳播物種，清理一些畜群，檢查整個(gè)畜群，然后將其清除。在病原體的純化中已獲得良好的結(jié)果。中國(guó)已經(jīng)充分研究并應(yīng)用了豬瘟去污措施。王勤建立了新的豬瘟凈化模型。目前，根據(jù)中國(guó)古典豬瘟的流行，在大型養(yǎng)豬場(chǎng)或某些地區(qū)完全有可能凈化豬瘟。在提煉病原體的同時(shí)，良好的育種管理和環(huán)境健康管理也很重要。致謝這次的畢業(yè)論文是在我的楊靜紅老師親切關(guān)懷和悉心指導(dǎo)下完成的。從畢業(yè)選題到設(shè)計(jì)完成，老師給予了我耐心指導(dǎo)與細(xì)心關(guān)懷，老師有嚴(yán)肅的科學(xué)態(tài)度，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)精神和精益求精的工作作風(fēng)，這些都是我所需要學(xué)習(xí)的，感謝老師給予了我這樣一個(gè)學(xué)習(xí)機(jī)會(huì)，謝謝!參考文獻(xiàn)：1.郭紅炳，馮尚連，呂金輝，規(guī)模化豬場(chǎng)豬病流行動(dòng)向及防治對(duì)策［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016(2)