多糖化學結構鑒定方案總結

經過分級純化的多糖在測定結構前須檢查其純度及測定分子量。檢查純度最常用的判斷方法：〔1〕用GC、HPLC測定組成多糖的單糖的摩爾比是否恒定。用不同的柱型測定結果更為可靠?！?〕電泳只出現(xiàn)一條帶。如可用聚丙烯酰胺凝膠電泳、乙酸纖維素薄膜電泳及玻璃纖維紙電泳。對于中性多糖可采用高壓電泳，以硼酸鹽為緩沖液，可增大其遷移速度?！?〕凝膠柱層析圖呈現(xiàn)對稱的單峰。假設有“拖尾〞現(xiàn)象，說明其均一性不夠好。陰離子交換層析純化用DEAE一纖維素52(2.6x100cm)柱層析,0.lmol/LNaCl洗脫,流速6ml/h,按2ml一管分部收集,苯酚一硫酸法逐管檢測,繪制收集體積與糖含量之間的關系曲線?？词欠裼袉我粚ΨQ峰。按照Ye等報道,采用DEAE一52一纖維素交換柱層析法(2.6x30cm)對鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖進行初步別離。DEAE一纖維素凝膠預處理:稱取DEAE一52一纖維素凝膠干粉,參加約10倍體積質量比(ml/g)的0.5mol/LNa0H溶液浸泡30分鐘,倒出上清液,用大量去離子水反復浸洗至pH值近中性;再用相同體積的0.5mol/LHCI溶液浸泡30分鐘,倒出上清液,用大量去離子水反復浸洗至pH值近中性;最后用相同體積的0.5mol/lNaOH溶液再浸泡30分鐘,用大量去離子水反復浸洗至pH值中性。處理完畢后,進行濕法裝柱,用去離子水0.5mol/LNaCl溶液,去離子水依次分別平衡(流速1.0ml/min)2一3個柱體積備用.糖樣100mg溶于5ml的去離子水中,離心除去不溶物,上樣于DEAE一52一纖維素陰離子層析柱(2.6x30cm,Cl-1型),分別采用去離子水0.1和0.3mol/LNaCI溶液進行分段梯度洗脫,流速1.0ml/min,自動收集器分部收集(10ml/管),每梯度20管。用硫酸一苯酚法跟蹤檢測各管多糖含量(490nm處吸收值),以收集的管數(shù)為橫坐標。吸光值(490nm)為縱坐標繪制DEAE一52一纖維素色譜柱洗脫曲線。依據(jù)洗脫峰型,合并相同組分,50℃旋轉蒸發(fā)濃縮,對去離子水透析48h以去除NaCI及小分子雜質,最后將透析內液冷凍枯燥,得初步純化產品。初步純化多糖得率計算公式:多糖得率(%)=純化多糖質量/粗多糖質量x100%葡聚糖凝膠層析純化采用SephadexG-100凝膠層析法對DEAE-52一纖維素初步純化的不同組分的多糖樣品進一步純化。葡聚糖凝膠(sephadexG一100)的預處理:稱取sephadexG一100凝膠干粉,參加30倍體積質量比(ml/g)的去離子水,沸水浴5小時使其溶脹。冷卻后用去離子水反復浸洗,減壓脫氣后進行濕法裝柱,用0.1MNa2SO4;溶液平衡(流速0.25ml/min)2一3個柱體積備用。分別稱取經DEAE一纖維素一52初步純化的各多糖組分樣品20mg,溶于2ml0.1MNa2SO4溶液中,上樣于SephadexG一100層析柱(2.6x60cm)用0.1MNa2SO4溶液溶液洗脫,流速0.25ml/min,分步收集(5ml/管)。用硫酸一苯酚法跟蹤檢測各管多糖含量(490nm處吸收值),以收集的管數(shù)為橫坐標。吸光值(490nm)為縱坐標繪制sePhadexG一100色譜柱洗脫曲線。依據(jù)洗脫峰型,合并相同組分,50℃旋轉蒸發(fā)濃縮,對去離子水透析48h以去除Na2SO4;及小分子雜質,最后將透析內液冷凍枯燥,得不同純化產品。純化多糖得率計算公式:純化多糖得率(%)=純化多糖質量/粗多糖質量x100%〔鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖〕紙層析法呈單一集中斑點。取0.5%的多糖樣品溶液50ul,點樣于新華中速濾紙(3cmx20cm)距端點1cm處的中部,以正丁醇:濃氨水:水(4O:50:5)為展開劑,飽和2小時以上,在室溫下展開6h,取出吹干,用0.5%甲苯胺藍液染色,立即用95%乙醇漂洗至背景褪色,看是否只有一個清晰的斑點?！?〕瓊脂糖(Agarose)凝膠電泳法在瓊脂糖板(厚度為0.2cm)上點樣3一5ul采用濃度為0.075mol/L,pH8.6的巴比妥緩沖液,電泳1-1.5h,電壓為64一80V,甲苯胺藍(濃度為1%)染色,醋酸乙醇混合溶液(醋酸:乙醇:水=0.1:5:5)脫色。多糖純品經電泳展開后,看是否呈現(xiàn)單一斑點,斑點是否清晰?！?〕紫外分光光度法將多糖PWZ加0.9%NaCI溶液溶解,配成濃度為1mg/ml的溶液,采用UV一16OA紫外可見光譜儀掃描(200nm一30Onm)觀察260nm、280nm處是否有吸收峰。多糖的分子量測定：過去用超速離心沉降法、光散射法、滲透壓法、粘度法等，這些方法操作復雜且誤差較大，現(xiàn)已少用?，F(xiàn)在較常用的方法有凝膠過濾法和高效凝膠液相色譜法，這兩種方法須先用分子量的標準多糖對照測定樣品的分子量。一般來說，多糖結構分析包括以下幾點：單糖組成分析：研究確定單糖的種類及摩爾比；完全酸水解后用高效液相色譜方法(HPLC)或氣相色譜方法測定。糖苷鍵類型：研究確定糖苷鍵及支鏈點連接位置；甲基化分析方法高碘酸氧化法與Smith降解法糖環(huán)大?。貉芯看_定糖苷鍵為呋喃糖或吡喃糖；紅外光譜異頭碳構型：研究確定糖苷殘基的a-或P-構型；2DNMR.(TwodimensionalNuclearMagneticResonance)光譜分析方法測確定單糖殘基和重復單元的序列甲基化分析方法與磁共振光譜分析方法結合分析，一般會參考多糖的單糖組成及摩爾比信息以利于解析多糖結構。高碘酸氧化法薄層層析(TLc)——定性，氣相色譜法取代基團位點：研究0H-修飾基團的種類和取代位點，如0-磷酸化，乙醜基取代，0-硫酷化等；比色分析方法多糖分子量分布的研究。紫外光譜定性與定量方法薄層層析：殘基定性氣相色譜：殘基定量氣質聯(lián)用：殘基定量高效陰離子色譜法：殘基定量鑒定結構常用物理化學方法：高效液相色譜:確定單糖組分和相對分子量紅外光譜分析:測定多糖的官能團，不僅可以檢測酮糖、酵糖的恥喃糖環(huán)或呋喃糖環(huán)的構象和糖苷鍵的構型核磁共振:α-構型與β-構型殘基的比例；判斷異頭碳構型；推斷主鏈和支鏈連接鍵型鑒定結構復合方法：甲基化分析:推斷出多糖樣品中糖基的連接方式及各種連接鍵型的比例高碘酸氧化法與Smith降解法:判斷糖苷鍵的位置、直鏈多糖的聚合度及支鏈多糖的分支數(shù)目糖睛乙酸酷衍生物的氣相色譜法:單糖組成和摩爾比各種多糖化學結構鑒定方法的具體實施方案酸水解完全酸水解稱取20mg樣品,參加2mL2mol·L-1的H2SO4于安培管中沸水浴水解8h,水解液用BaCO3中和至pH=7,離心,取上清夜置冰箱冷藏備測。〔阿魏側耳子實體多糖別離純化及其化學結構的初步研究〕局部酸水解稱取糖樣70mg，80℃條件下，0.05M三氟乙酸水解2h。降至室溫后，離心〔4000r/min，10min〕，將沉淀枯燥，留做GC分析。上清用無水乙醇除酸至中性(pH為6～7)，蒸餾水透析48h：將袋外透析液濃縮，真空枯燥，留做GC分析；袋內液濃縮至5ml左右，加10倍體積無水乙醇，醇沉過夜，離心(4000r/min，10min)，沉淀常規(guī)枯燥，作GC分析；上清濃縮，真空枯燥，留做GC分析。高效液相色譜確定樣品的單糖組成色譜條件為:色譜柱為ShodexKS804Sugar(300mm×7.8mm)柱溫40度流動相為水流速0.8mL·min-1檢測用410RⅠ示差檢測器，數(shù)據(jù)處理用810GPC軟件進行。同時用鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、木糖、果糖、葡萄糖、巖藻糖8種單糖進行對照,根據(jù)峰值確定樣品的單糖組成。分子量的測定以標準分子量的葡聚糖Pulluan作分子量測定標準。讓其通過高壓液相色譜柱,條件同上,先以分子量對數(shù)與對應的保存時間作標準曲線,從標準葡聚糖Pulluan的工作曲線上可以求得該成分分子量。例如：〔阿魏側耳子實體多糖別離純化及其化學結構的初步研究〕將水解后的多糖樣品PW2進行HPLC分析,結果如表所示:阿魏側耳子實體多糖PW2經過酸水解后,得到2種單糖:葡萄糖和半乳糖,摩爾比例1.77∶1。例如：經HPLC測定后對照標準曲線得多糖PW2的分子量為3.18×104?！舶⑽簜榷訉嶓w多糖別離純化及其化學結構的初步研究〕甲基化分析(1)根本原理先將多糖中各種單糖殘基中的游離羥基全部甲基化，然后將多糖中的糖苷鍵進行完全酸水解，水解后得到的化合物，其羥基所在的位置，即為原來單糖殘基的連接點。同時根據(jù)不同甲基化單糖的比例，可以推測出此種連接鍵型在多糖重復結構中所占的比例。用此種方法得到的羥基及NaBH4復原醛基后產生的羥基，經乙?；傻玫郊谆奶谴家宜狨?此產物易揮發(fā)，可進行GC分析)，再經GC與GC-MS分析，通過氣相色譜的出峰順序和對質譜譜圖的主要離子碎片的分析便可以較準確地確定糖的連接鍵型。反響通式如下:〔2)甲基化反響取充分枯燥的多糖樣品10mg，溶解在2.0ml的二甲基亞礬〔DMSO)中。在N2保護下快速參加枯燥的NaOH粉50mg，用N2排出空氣，加蓋密封，室溫反響1.0h并間歇振蕩。在N2保護下緩慢滴加碘甲烷1.0ml，用N2排出空氣，加蓋密封，室溫繼續(xù)反響1.0h并間歇振蕩，反響完成后加0.5ml水終止反響。反響液先用自來水流水透析48h，再用蒸餾水透析24h，透析液冷凍枯燥得第一次甲基化樣品。第一次甲基化樣品繼續(xù)甲基化，反響步驟同上，得第二次甲基化樣品。如此重復甲基化三次。甲基化后的樣品用紅外光譜檢測，3700cm-1—3100cm-1，附近無羥基的特征吸收峰，說明甲基化反響完全。〔3)甲基化樣品的衍生化上述完全甲基化多糖樣品參加2mol/1的三氟乙酸(TFA)3.0ml,120℃密閉水解2.0h。冷卻后50℃減壓蒸發(fā)干，加2.0ml甲醇再蒸發(fā)干，重復三次，最后蒸發(fā)干得完全甲基化多糖的水解產物。加蒸餾水2.0ml使其溶解，再加硼氫化鈉25mg，振蕩后室溫復原反響2.0h。反響完后滴加0.1mol/1醋酸分解過量的硼氫化鈉并調pH值至5.5~7.0弱酸性。反響液50℃減壓蒸發(fā)蒸干，加2.0ml甲醇再蒸干，重復三次，最后蒸發(fā)干。上述蒸發(fā)干樣品參加1.0ml醋酸酐和1.0ml吡啶，封管后在沸水浴中反響1.0h。反響液50℃減壓蒸發(fā)干，加2.0ml甲醇再蒸發(fā)干，重復三次，最后蒸發(fā)干。參加丙酮1.0ml，用0.45ul尼龍微孔濾膜過濾，取樣進行GC/MS分析。(4)衍生化樣品的GC/MS分析多糖樣品經甲基化、水解、復原、乙?；蟮玫郊谆谴家宜狨?，進行GC/MS聯(lián)機分析，根據(jù)文獻的相對保存時間和不同單糖的主要離子碎片(m/e〕，推斷出多糖樣品中糖基的連接方式及各種連接鍵型的比例。本實驗采用的條件為:GC(VarianCP3800型)和MS〔VarianSatum2200型)氣相一質譜聯(lián)用儀，DB-5MS石英毛細管柱(30mX0.25mmX0.25um);程序升溫，初溫80℃，保持1min，以8℃/min升至210℃，保持1min，再以20℃/min升至260℃,保持1min;氦氣作載氣，進樣口溫度250℃，分流比1:50，柱流速1.0ml/min;電子電離源(EI源)70eV，倍增器電壓350V，燈絲電流250uA，接口溫度260℃,離子源溫度180℃，質荷比(m/z)掃描范圍30~450，掃描速率2.5scan/sec?！舶綄涌拙z體多糖別離純化、結構鑒定及其生物活性研究〕流程圖如下：〔MAEP-2a-2b是安絡小皮傘菌絲體多糖的某個過程中第某個樣品〕例如：經過甲基化反響的MAEP-2b-2a通過GC-MS分析，結合其各峰位保存時間和質譜碎片峰，判斷樣品的結構并計算摩爾百分比。從表14中，可以看出MAEP-2b-2a中糖局部是以〔1→2,1→6〕連接的Man〔甘露糖〕為主鏈?！?→2〕連接的Man〔甘露糖〕在其4位上有分枝點,〔1→6〕連接的Man在其2位上有分枝點。在這些分枝點上，連接著由Gal和Glu為主組成的側鏈。MAEP-2b-2a的非復原末端是由Gal,Man,Glu組成。從甲基化結果的摩爾百分比計算，各分枝點摩爾百分比之和低于非復原末端摩爾百分比之和，由PMP衍生化組成糖分析結果可知，MAEP-2b-2a尚含約9%的GalA，糖醛酸在復雜多糖中可能以分枝點的形式存在，故推測在MAEP-2b-2a中還有大量的GalA作為分枝點而存在?！步j小皮傘菌絲體多糖〕〔茶源多糖結構鑒定〕5、紅外光譜分析取枯燥樣品微量,壓片,全波段掃描。例如：阿魏側耳子實體多糖別離純化及其化學結構的初步研究圖中顯示在4000cm-1～650cm-1區(qū)內的是具有多糖類物質的一般特征。3372cm-1的吸收峰是O-H和N-H的伸縮振動峰,2931cm-1為C-H的吸收峰,即為-CH和-CH2的共振吸收鋒。這兩類是糖類的特征吸收峰。848cm-1吸收峰說明在PW2〔文中提純的第二種成分〕多糖純品結構中存在α型(即α端基差向異構體),1026cm-1、1081cm-1和1152cm-1的吸收峰說明PW2中的糖環(huán)為吡喃糖環(huán),這是由醚鍵C-O-C振動而產生的吸收峰;而呋喃糖環(huán)在此區(qū)間上只有兩個強吸收峰。在890cm-1處有微弱吸收,說明樣品中含有少量β型糖苷鍵,而在810cm-1處沒有振動吸收峰說明沒有甘露糖的存在。928cm-1為糖類分子振動吸收峰,即D-吡喃糖的非對稱環(huán)伸縮振動產生。而1725cm-1的存在,說明多糖含有糖醛酸基團,即PW2為酸性多糖。核磁共振將樣品10mg,溶于D2O(重水)中,溶解溫度80℃,分別在400MHz和500MHz上測定1HNMR和13CNMR?！舶⑽簜榷訉嶓w多糖別離純化及其化學結構的初步研究〕〔1〕氫譜分析例如：5.39吸收峰說明樣品的主要構型為α-構型,由于存在4.97吸收峰的存在,說明存在少量的β-構型(α-構型C-1信號在δ103以下,H-1信號在δ5.0以上;β-構型C-1信號在δ104以上,H-1信號在δ5.0以下)。且α-構型與β-構型殘基的比例為1∶0.2843。碳譜分析例如：由圖及表2可以看出:C-1信號在100.4ppm,即處在90-103之間,說明多糖的異頭碳的構型為α-構型,同時可以看到存在一個微弱的117ppm峰,說明樣品中有少量的β-構型,峰的相對高度正比于碳的數(shù)目,即α-構型與β-構型殘基的比例為1∶0.29,這個結果和紅外光譜以及氫譜的結論完全吻合。圖中70～76之間的碳共振峰分別是未被取代的C-2、C-3、C-4,其中,α與β兩種構型的共振峰重疊嚴重,由于77.906為被取代的C-4的糖苷鍵的共振峰,圖中可以看出存在重疊峰,這是由于α與β兩種構型和兩種單糖造成的,〔小邱：不是很明白它的意思，后面推測說應該是C-4上有支鏈〕C-6局部共振峰由61.114向低場移動到69.977說明多糖PW2存在1-6糖苷鍵,根據(jù)峰高比例可以大約看出多糖PW2的主鏈為1-6糖苷鍵,存在1-4糖苷鍵的支鏈。由C-1和C-6的峰高比例可以看出多糖PW2的支鏈不多。高碘酸氧化法與Smith降解法〔1〕原理高碘酸氧化是一種選擇性的氧化反響，它只能作用于多糖分子中連二輕基及連三輕基處。當連二輕基的C-C鍵被斷開后，產生相應的醛;當斷裂連三輕基的C-C鍵時，產生甲酸及相應的醛。此反響定量進行，每斷開1molC-C鍵，消耗1mol高碘酸，由此可知，每生成1mol甲酸必然對應消耗2mol高碘酸。因此，通過測定高碘酸消耗量及甲酸生成量，便可以判斷糖苷鍵的位置、直鏈多糖的聚合度及支鏈多糖的分支數(shù)目等。高碘酸氧化產物經NaBH4復原，得到的多糖醇用稀酸在溫和條件下水解，可發(fā)生特異性降解，即Smith降解。Smith降解的特點是只打斷被高碘酸破壞的糖苷鍵，而未被高碘酸氧化的糖殘基仍連在糖鏈上。這樣，多糖醇經Smith降解，就可以得到小分子的多元醇和未被破壞的多糖或寡糖片段，對這些產物進行分析，便可以推斷出糖苷鍵的鍵型及其位置。(2)高碘酸鈉標準曲線繪制各取適量的NaI04(15mmol/L)和NaIO3(15mmol/L)溶液，以5:0,4:1,3:2,2:3,1:4和0:5的體積比分別相混合。取不同比例的混合液0.1ml稀釋250倍至25ml，分光光度計測量各管223nm處的吸光值。以混合液中的NaI04濃度(mmol/L)為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制NaIO4標準曲線。(3)高碘酸氧化精確稱取多糖樣品25mg，用15mmol/1的NaIO4溶液將多糖配成1.0mg/ml〕溶液，振蕩使其溶解。2h后取多糖溶液0.1ml稀釋250倍至25ml，分光光度計測量223nm處的吸光值。多糖溶液置4℃冰箱，暗處反響，并間歇振蕩。間隔6h取樣0.1ml稀至25ml，測223mn處吸光值，直至吸光值根本穩(wěn)定。根據(jù)反響前后的吸光值和NaIO4標準曲線計算出NaIO4消耗量。加乙二醇1.0ml，靜置反響1h以復原過量的高碘酸。取反響液1.0ml，加50ul酚酞指示劑，用0.5mmol/L的NaOH溶液滴定，計算甲酸的生成量。反響液加硼氫化鈉50mg，靜置反響20h以復原多糖醛成穩(wěn)定的多羥基化合物。用0.1mol/L的乙酸調反響體系的pH值為5.5-7.0，分解多余的硼氫化鈉。反響液用自來水流水透析48h，再用蒸餾水透析24h。透析液50℃減壓蒸發(fā)至干，參加甲醇2.0ml，再蒸干，如此重復3次，最后蒸干獲多糖的高碘酸氧化產品待作Smith降解使用?！?)Smith降解及GC分析將減壓蒸干的多糖高碘酸氧化產品，進行三氟乙酸(TFA)水解，再制備糖腈乙酸酯衍生物，最后用GC進行檢測。7、糖腈乙酸酯衍生物的氣相色譜法〔鮑氏層孔菌菌絲體多糖的結構分析〕〔1〕多糖樣品水解采用完全酸水解法。稱取多糖樣品5mg置安瓶瓶中,參加2mol/1三氟乙酸(TFA)2ml封管,120℃水解2小時。水解液50℃條件下旋轉蒸發(fā)至干,參加甲醇約2ml,再蒸發(fā)干,如此重復3次,最后蒸干待作衍生化使用。(2)糖腈乙酸酯衍生物的制備水解后的糖樣中參加10mg鹽酸羥胺、5mg肌醇(內標物)、0.6ml吡啶，封口，放入90℃水浴中加熱反響30min并振蕩。冷至室溫，再參加1.0ml醋酸酐，90℃水浴中繼續(xù)反響30min，冷卻后得糖腈乙酸酯衍生物。反響產物可直接用于氣相色譜分析。(3)衍生物的氣相色譜檢測本實驗采用的條件為:Agilent6890N氣相色譜儀，5%苯甲基硅氧烷毛細管色譜柱HP-5，30.0mX320umX0.25um;氫火焰離子檢測器(FID);色譜柱程序升溫:1200C保持3min，以30C/min速度升溫至2100C,2100C再保持4min;進樣口、檢測器溫度分250℃、280℃;進樣體積1.0ul,氮氣、氫氣和空氣的流速分別是25ml/min,30ml/min,400ml/min。(4)標準單糖衍生與檢測鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖以及半乳糖等標準單糖同樣進行糖睛乙酸酷衍生化，然后以同樣條件進行氣相色譜分析。根據(jù)色譜圖中各色譜峰的出峰時間、峰面積以及單糖本身的摩爾質量可知樣品的單糖組成和摩爾比。計算公式:Wx=(Ax*Wi)/(Ai*f)。公式中Wx一樣品中單糖質量(mg);Wi一樣品中參加內標的質量(mg);AX—樣品中單糖的峰面積;Ai—樣品中內標的峰面積;f—相對校正因子:f=Wi*As/(Ws*Ai)。薄層層析(TLc)單糖殘基的定性分析(猴頭菌實體多糖)薄層層析(TLc)：取2mg多糖樣品放入薄壁長試管中,參加2mol/L三氟乙酸(TFA)4mL,在110℃下水解,中性多糖樣品水解2h,含糖醛酸樣品水解4h。樣品水解溶液減壓蒸干(低于40℃)后,參加3mL甲醇再蒸干,重復以上步驟4一5次,以完全除去TFA。再向樣品中參加0.5mL左右的蒸餾水使樣品完全溶解,取5uL在纖維素板上進行薄層層析,展開劑采用乙酸乙酯:吡啶:醋酸:水(5:5:1:3),顯色劑為苯胺一鄰苯二甲酸,110℃加熱10min后顯色,以標準單糖樣品為對照。(山藥多糖)氣相色譜法〔猴頭菌體多糖〕〔1〕標準單糖樣品的乙?；芊Q取等摩爾(2mmol/L)的半乳糖、巖藻糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖、甘露糖和阿拉伯糖，分別溶于3mL蒸餾水中，參加20-30mg硼氫化鈉(NaBH4)，于室溫下，間歇振蕩，復原3h，然后用冰醋酸中和過量的NaBH4，至溶液不再產生氣泡為止，pH應在4-5之間，參加3mL甲醇，減壓濃縮蒸干，重復4-5次，以除去反響副產物硼酸及水分，然后置于真枯燥器中過夜。次日，110℃烘箱中加熱15min，充分除去殘留的水分后，參加4mL醋配，100℃反響1h，冷卻，然后參加3mL甲苯，減壓濃縮蒸干，重復4-5次，以除去多余的醋酐。將乙?；蟮漠a物用3mL氯仿溶解后轉移至分液漏斗，參加少量蒸餾水充分震蕩后，除去上層水溶液，如此重復4次。氯仿層以適量的無水硫酸鈉枯燥，定容至10mL待GC和GC-MS分析?！?〕樣品的乙酰化處理取2mg多糖樣品，放入薄壁長試管中，參加2mol/L的三氟乙酸(TFA)4mL，在110℃水解2h。將水解液低于40℃減壓蒸干，然后參加3mL甲醇蒸干，重復上述操作4-5次，以完全除去TFA。然后按照上述的方法進行復原、乙酞化，用氯仿定容至5m1，待GC和GC-MS分析。〔3〕GC分析及定量分別用單個單糖的標樣按〔1〕法處理后用GC測定，確定每個單糖的保存時間。然后用單糖的混標按〔1〕法處理后用GC測定，重復進樣6次，確定混合標準樣品的氣相色譜圖和相對標準偏差(RSD1)。最后按〔1〕法平行處理六個混標樣品后用GC測定，確定其相對標準偏差(RSD2)。糖的定量分析:計算各糖組分的峰面積，利用面積歸一法求出各糖組分的百分比例，并計算每種單糖的響應因子。然后根據(jù)等摩爾的標樣組分，計算出樣品的摩爾比?！?〕色譜條件氣相色譜儀(GC)配備DB-23石英毛細管柱，30mX0.25mmX0.25um。氫火焰離子化檢測器(FID)，高純氮作載氣。程序升溫:柱初溫120℃，以15℃/min升至240℃，恒6.5min。進樣口溫度250℃，分流比1:50。檢測器溫度250℃氫氣35mL/min，空氣350mL/min，尾吹氣30mL/min。柱流速為1mL/min。高效陰離子色譜法〔猴頭菌體多糖〕取2mg多糖樣品放入薄壁長試管中，參加2mol/L三氟乙酸(TFA)4mL，在110℃下水解，中性多糖樣品水解2h，用超純水溶解定容至100mL容量瓶，稀釋100倍后上樣測定。色譜條件:別離柱采用Dionex公司CarboPacTMPA20預處理、CarboPacTMPA20檢測柱;脈沖安培檢測器工作參數(shù):E1為100mv,400ms;E2為-2000mv,20ms;E3為600mV,10ms;E4為-100mV,70ms。流動相:分別采用濃度為2.5mmol/L的NaOH作淋洗液;淋洗方法采用單一濃度淋洗。流速:0.45mL/min;上樣量:25uL;溫度30℃。氣質聯(lián)用〔猴頭菌體多糖〕取處理的乙?；a物，上GC-MS，色譜條件:氣相一質譜聯(lián)用(GC-MS)配備DB-5MS石英毛細管柱，30mX0.25mmX0.25um。程序升溫:柱初溫80℃，保持1min，以50C/min至2000C，再以20C/min至215℃，最后以20℃/min至270℃氦氣作載氣，進樣口溫度250℃，分流比1:50，柱流速為1mL/min。EI(70eV)，倍增器電壓350v，燈絲電流250uA，接口溫度200℃，離子源溫度250℃，質量數(shù)掃描范圍42-462amu，掃描速率2.5scan/秒。根據(jù)HEPF1的總離子流圖(圖3.6)，通過各峰的保存時間和質譜可以確定其含有巖藻糖、葡萄糖和半乳糖，但是在保存時間22.58min處有一未知物峰。根據(jù)22.58min處的質譜圖(圖3.7)可知，該組分在m/z43,87,101,117,129,143,189和203處有碎片離子峰。其中m/z203和189是3-0-甲基一甲基戊糖糖醇乙酸醋衍生物的一級片段，而耐z129和143是由一級片段m/z189和203局部裂解產生乙酸根(-AcOH,-60)而產生的二級片段，與文獻完全一致。由此可以斷定此峰是3-0-甲基一甲基戊糖的糖醇乙酸酷衍生物。由于3-0-甲基一甲基戊糖有兩種存在形式，3-0-甲基一鼠李糖或3-0-甲基一巖藻糖，判斷具體的哪一種，還需要進一步驗證。12、苯酚·硫酸法總糖含量測定〔1〕標準曲線的制作葡萄糖標準品在105℃烘箱條件下枯燥至衡重，取20mg于500mL容量瓶中定容。分別吸取0.4mL,0.6mL,0.8mL,1.0mL,1.2mL,1.4mL,1.6mL,1.8mL葡萄糖標準液于試管中，并加水補至2.0mL。參加配制好的6%苯酚溶液1.0mL，用移液管吸取5.0mL濃硫酸，待靜止10min后搖勻，再在室溫下放置20min，待反響完全。于490nm下測吸光度，并繪制標準曲線?！?〕樣品含量測定配制1mg/mL的粗多糖溶液。稀釋后，測定吸光值，根據(jù)標準曲線計算總糖含量。13、糖醛酸含量測定〔1〕試劑配制間輕基聯(lián)苯(m-hydroxydiphenyl)試劑:0.15%間輕基聯(lián)苯，以0.5%氫氧化鈉配制，置于冰箱中保存，1月內穩(wěn)定。四硼酸鈉一硫酸試液:配制0.0125mol/L四硼酸鈉的濃硫酸溶液。半乳糖醛酸標準溶液:精密稱取半乳糖醛酸60mg，置于100mL容量瓶中，加水溶解，定容。稀釋標準溶液至60ug/mL，定容后備用?！?〕標準曲線制作分別精確量取0uL，5uL，100uL，150uL,200uL，250uL,300uL,350uL半乳糖醛酸標準溶液于比色管中，補加水至0.25mL，在冰水浴中預冷，參加1.5mL四硼酸鈉硫酸試液。振搖混合后，在沸水浴中加熱5min。冰水浴冷卻至室溫后，加25uL間經基聯(lián)苯試液。搖勻后，在520nm處測定吸光值，繪制標準曲線。(3)樣品測定取0.1mg/mL多糖水溶液0.1mL，加水補足至1mL，余操作同標準曲線，平行測定三次，根據(jù)吸光度從標準曲線上求得糖醛酸含量。14、分子質量測定示差折光指數(shù)增量(dn/dc)通過OPTILAB折光儀在633nm和25℃下測定，dn/dc值為0.14。dn/dc描述的是大分子溶液折光指數(shù)相對于溶質濃度的變化，它的值得大小有其自身性質決定的，受溶劑、溫度、測量波長等因素的影響，也是用光散射測定聚合物分子量不可少的常數(shù)。光散射(LS)測定角度為900，TFP1的流出體積為28mL。根據(jù)方程6-1和6-2，通過Kc/Rθ。對sin2(θ/2)+Kc作圖得到Zimm曲線(圖15(b))，在縱坐標的交點為重均分子量Mw的倒數(shù)。公式中字母的意義:K為光學常數(shù)，c為多糖溶液的濃度(mg/mL)，Rθ為瑞利因子，n為溶劑的折光指數(shù)，λ0為入射光波長，<S2>z1/2均方根旋轉半徑，NA為Avogadro常數(shù)，I0和Iθ分別為入射光強和散射光強，代表光源到測量點得距離。根據(jù)Zimm圖計算得到TFPl在NaCl溶液中各個參數(shù)見表1,TFPl的重均分子量(Mw)大小為5.832xl06Da;Z均方根旋轉半徑(<S2>z1/2)是用來描述大分子的尺寸,它的大小可以用來判斷聚合物的伸展范圍和剛性,該值比擬大時說明多糖是伸展的剛性鏈,值比擬小那么代表緊密纏繞的線團,TFP1的<S2>z1/2為191.3nm說明TFP1是伸展的剛性鏈;多分散系數(shù)(Mw/Mn)為1.005,說明TFP1分子量分布均勾。所以用本研究中的提取純化方法得到的銀耳多糖TFP1是分子量較大的均一多糖,糖鏈是伸展的剛性鏈。14、碘-碘化鉀反響銀耳多糖TFP1溶液與碘試劑(含0.02%12的0.2%KI溶液)混勻,測定300-700nm范圍內的吸收光譜,假設在565nm處有最大吸收那么說明多糖有較少的分支和較短的側鏈[161。如圖16所示,TFP1與I2-KI的反響物最大吸收峰在351nm,而565nm處并沒有最大吸收,說明TFP1可能存在較長的側鏈和較多的分支。另外,TFP1與I2-KI反響呈陰性,說明不含淀粉。15、剛果紅實驗剛果紅是一種酸性染料,分子式C32H22N6Na2O6S2,分子量696.66,能溶于水和乙醇,可與具有三股螺旋構象的多糖形成絡合物,絡合物的最大吸收波長同剛果紅相比發(fā)生相對位移,在一定的NaOH濃度范圍內,表現(xiàn)為最大吸收波長特征性變化(變成紫紅色),當NaOH濃度大于0.3mol/L后最大吸收波長急劇下降。假設隨著NaOH的濃度升高,多糖最大吸收波長相應減小,但相對于剛果紅本身最大吸收波長減少明顯緩慢,那么說明多糖未表現(xiàn)出三股螺旋結構。如圖17,隨著NaOH的濃度升高,剛果紅與銀耳多糖形成的絡合物的最大吸收波長相應減小,但相對于剛果紅本身最大吸收波長減小的緩慢,說明銀耳多糖TFP1可能不具有三螺旋結構。16、粘度檢測高分子的粘度是流體力學性質的內容,反映高分子之間的摩擦力,特性粘度值反映的是單個高分子在特定濃度下對溶液粘度的奉獻,其值的大小并不隨濃度改變而改變,多糖溶液特性粘度([?])與分子量大小有關。Kh和Kk分別為高分子在特定條件下某溶劑中的常數(shù);[?],特性粘度;?sp增比粘度;?r相對粘度;C,高分子溶液濃度。由Huggins方程(y=1146547.14x+1508.83)和Kraemer方程(y=-189179x+1507.8)計算的TFPl的特性粘度[?]=1508.3mL/g(如圖18)。表2中是一些生物多糖在25℃并以0.1mol/LNaCl作為溶劑的條件下測定的特性粘度,銀耳多糖與其它一些樣品相比占有相對較大的流體力學體積,一定條件下特性粘度與分子量大小成正比,進一歩說明TFP1