四逆散凍干粉的rp-hplc法分析

四逆散凍干粉的rp-hplc法分析

東漢張仲景《傷寒》的第一部著作，由柴胡、白芍、桔梗和甘草組成。為和解少陽,調(diào)和肝脾的基礎(chǔ)方劑,具有解郁透熱、疏肝理脾、宣散氣血郁滯之功。中藥復方是中醫(yī)臨床用藥的主要形式,化學成分是中藥復方發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。中藥指紋圖譜技術(shù)是一種綜合的、可量化的化學分析鑒定手段,它的出現(xiàn)為分析中藥復方化學成分提供了技術(shù)手段,因此,復方指紋圖譜反映的不僅是所含藥物本身的信息,也反映了復方整體的天然組合化學庫。近年來,經(jīng)過本實驗對中藥復方四逆散凍干粉的鎮(zhèn)靜催眠作用藥效學研究發(fā)現(xiàn),其在改善睡眠、提高睡眠質(zhì)量方面具有獨特的療效,采用RP-HPLC法構(gòu)建四逆散凍干粉指紋圖譜,并進行了拆方對比分析,對四逆散凍干粉化學成分變化的分析研究,為揭示其改善睡眠作用藥效物質(zhì)提供可靠依據(jù)。1儀器和試劑盒1.1超聲清洗器日本島津2010—A高效液相色譜儀、電子分析天平AE240(十萬分之一,瑞士METTLER-TOLEDOCo.)、CQ250超聲波清洗器(上海超聲波儀器廠)。1.2藥品、藥材與藥品對照品柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、甘草酸單銨鹽(質(zhì)量分數(shù)均為98%以上,由成都思科華生物技術(shù)有限公司提供);甘草次酸(批號110723-200310)、橙皮苷(批號110721-200211)、柚皮苷(批號110722-200309)、芍藥苷(批號110736-200422)由中國藥品生物制品檢定所提供。柴胡(傘形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.)購于河北省安國市康信義藥材行,產(chǎn)地為陜西;白芍(毛茛科植物芍藥PaeonlalactifloraPall.)、炙枳實(蕓香科植物酸橙CitursaurantiumL.)、炙甘草(豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.)購于哈爾濱市世一堂中藥飲片廠。以上藥材均由黑龍江中醫(yī)藥大學生藥學教研室都曉偉教授鑒定。乙腈(HPLC級,美國DIKMA公司提供),水(Milliporewaterpurificationsystems制備)、磷酸(優(yōu)級純,北京益利精細化學品有限公司提供)。2方法和結(jié)果2.1對照品溶液的制備取芍藥苷,柚皮苷,橙皮苷,甘草酸,柴胡皂苷a、d,甘草次酸混合對照品3mg精密稱定,置5mL量瓶中,加75%甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻。精密吸取上述溶液0.5mL置10mL量瓶中,用75%甲醇定容,即得。2.2制備四逆散凍干粉精密稱取組成四逆散的4味藥材、缺味四逆散(四逆散缺白芍、四逆散缺枳實、四逆散缺柴胡、四逆散缺甘草)及四逆散藥材適量,加入10倍量水,煎煮2次,每次1h,濾過,合并濾液,減壓濃縮至稠膏狀,并于70℃水浴濃縮至0.8g生藥/mL。采用先煎煮后冷凍干燥工藝制備四逆散凍干粉備用。工藝如下:-40℃制冷,-20℃保凍2h,-10℃保凍16h,20℃干燥5h,35℃二次干燥2h。此工藝條件下,獲得的四逆散凍干粉凍型飽滿,復水性好,呈淡黃色,網(wǎng)狀疏松,水分小于1%。2.3供試品溶液的制備精密稱取四逆散凍干粉120.5mg(相當于每味生藥105.8mg)置于25mL量瓶中,加入75%甲醇20mL,密閉超聲40min,定容至刻度,0.45μm濾膜過濾待測。同法,分別精密稱取柴胡凍干粉15.8mg(相當于154.6mg柴胡生藥)、拆方1(去柴胡)凍干粉97.5mg(相當于每味生藥99.0mg)、白芍凍干粉4.4mg(相當于171.3mg白芍生藥)、拆方2(去白芍)凍干粉87.5mg(相當于每味生藥100.2mg)、枳實凍干粉39.3mg(相當于103.5mg枳實生藥)、拆方3(去枳實)凍干粉72.7mg(相當于每味生藥104.8mg)、甘草凍干粉41.1mg(相當于102.4mg甘草生藥)、拆方4(去甘草)凍干粉71.3mg(相當于每味生藥102.5mg)制成供試品溶液待測。2.4流動相、檢測波長色譜柱為KromasilC18柱(250mm×4.6mm,5μm);流動相:乙腈-磷酸水(pH3)(梯度見表1);檢測波長:210、240nm;體積流量:1.0mL/min;柱溫:28℃。2.5方法研究2.5.1藥苷、柚皮苷、糖皮苷、甘草次酸峰面積rsd取對照品混合溶液,連續(xù)進樣6次,測定芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、甘草酸、甘草次酸峰面積RSD分別為0.98%、1.02%、1.12%、0.95%、1.24%。2.5.2各進樣樹高-月酸峰面積rsd取同一份供試品溶液在上述色譜條件下,分別在0、6、12、24、36、72h各進樣10μL,測定芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、甘草酸、甘草次酸峰面積RSD分別為1.01%、0.95%、1.12%、1.35%、0.98%。表明樣品在72h內(nèi)穩(wěn)定。2.5.3各品種甘草酸量srd的測定按“供試品溶液的制備”方法,取同一批樣品分別制備6份供試品溶液,各吸取10μL進樣測定,測得芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、甘草酸量的RSD分別為1.23%、1.44%、1.01%、1.45%。2.5.4回收率的測定采用加樣回收測定法。分別精密稱取已知量的樣品共6份,分別加入一定量的芍藥苷、柚皮苷、柴胡皂苷a、甘草次酸對照品,按供試液制備方法制備樣品6份,進樣量10μL,進行HPLC測定,測得芍藥苷、柚皮苷、柴胡皂苷a、甘草次酸的平均回收率分別為99.96%、98.75%、99.02%、100.08%;RSD分別為1.37%、1.65%、2.04%、1.96%。2.6四散框架理論的形成2.6.1逆散合方后存在的化學成分取柴胡、拆方1、四逆散凍干粉供試品溶液,進樣量10μL,HPLC檢測,同波長下進行圖譜比對,并比較芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、甘草酸的量。結(jié)果見圖1和表2。在240nm檢測波長下,四逆散凍干粉色譜圖中15和19號成分峰與柴胡凍干粉中相對應(yīng)峰的保留時間及紫外吸收光譜均相同,但四逆散凍干粉色譜圖中“*”號成分峰,在拆方1煎煮物及柴胡煎煮物圖譜中未出現(xiàn),提示在四逆散合方煎煮過程中產(chǎn)生了新的化學成分。結(jié)果表明,四逆散中柚皮苷、甘草酸的量高于拆方1的量,提示柴胡的加入對這兩種成分有一定的增溶作用。在210nm檢測波長下,17號峰來自柴胡,四逆散色譜圖未出現(xiàn)柴胡皂苷a、d成分峰,根據(jù)以往文獻報道,柴胡皂苷類成分不穩(wěn)定,易發(fā)生次生化反應(yīng)而轉(zhuǎn)化,因此,四逆散中未檢測到柴胡皂苷類成分。210nm波長色譜圖中17號峰為240nm波長色譜圖15號峰保留時間及紫外吸收光譜圖一致,說明二者為同一成分,只是在不同波長下的響應(yīng)值不同而已。2.6.2逆散凍干粉中葉綠素的含量取白芍、拆方2、四逆散供試品溶液,進樣量10μL,HPLC檢測,同波長下進行圖譜比對,并比較芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、甘草酸的量。結(jié)果見圖2和表3。在240nm波長下,通過比較分析發(fā)現(xiàn),四逆散凍干粉色譜圖1、5和6號峰與白芍中相應(yīng)位置處成分的保留時間及紫外吸收光譜相同,因此1、5和6號峰均來自白芍,其中6號峰為芍藥苷;測定結(jié)果表明,在方劑配伍后,芍藥苷溶出量明顯高于其單煎物的溶出量,約是其8倍,提示其他3種藥物對白芍成分具有較強的增溶作用。四逆散凍干粉中柚皮苷、橙皮苷、甘草酸的量均高于其拆方2凍干粉中的量,說明白芍對其他藥物成分也有一定的助溶作用。在210nm檢測波長下,經(jīng)過比較后發(fā)現(xiàn),四逆散凍干粉色譜圖中1、6、7、11號峰均來自白芍。其中7號峰成分為芍藥苷;210nm下的1號峰成分與240nm下的1號峰成分保留時間及紫外吸收光譜圖一致屬同一成分;210nm下的6號峰成分與240nm下的5號峰成分為同一物質(zhì);210nm下的11號峰成分在240nm下無吸收。2.6.3成分峰取枳實、拆方3、四逆散凍干粉供試品溶液,進樣量10μL,HPLC檢測,同波長下進行圖譜比對,并比較芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、甘草酸的量。結(jié)果見圖3和表4。在240nm波長下,四逆散凍干粉色譜圖中2、3、4、8、9、10、11、12、13、20號成分峰保留時間及紫外吸收光譜與枳實凍干粉中相應(yīng)位置成分峰均相同,說明這些成分峰來自枳實,其中11號峰為柚皮苷,12號峰為橙皮苷;測定結(jié)果表明,全方煎煮后,枳實中柚皮苷、橙皮苷成分溶出量比枳實單煎物高;同時,配伍枳實的四逆散凍干粉甘草酸量高于缺少枳實的拆方凍干粉中的量,提示四逆散中其他藥物對枳實中成分起到增溶作用,枳實對甘草中甘草酸的溶出亦具促進作用。在210nm波長下,2、4、5、9、10、12、13、14、15、18、19、21、22、24號成分峰保留時間及紫外吸收光譜與枳實凍干粉中相應(yīng)位置成分峰均相同,說明這些成分峰均來自枳實,其中13號峰為柚皮苷,14號峰為橙皮苷;210nm波長下4號峰與240nm波長下2號峰保留時間及紫外吸收光譜均相同屬同一成分;同理可以推斷,210nm下9號峰與240nm下8號峰亦屬同種成分;210nm下12號峰與240nm下10號峰為同種成分;210nm下15號峰與240nm下13號峰屬同一成分;210nm下21號峰與240nm下20號峰為同一物質(zhì)。2.6.4逆散凍干粉檢測取甘草、拆方4、四逆散凍干粉供試品溶液,進樣量10μL,HPLC檢測,同波長下進行圖譜比對,并比較芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、甘草酸的量。結(jié)果見圖4和表5。在240波長下,經(jīng)過比較分析后發(fā)現(xiàn),四逆散凍干粉色譜圖中7、14、16、17和18號成分峰保留時間及紫外吸收光譜圖與甘草凍干粉中相應(yīng)峰均相同,可以推斷這些成分來自甘草,其中18號峰為甘草酸;測定結(jié)果表明,配伍甘草后凍干粉與去掉甘草凍干粉比較,芍藥苷、橙皮苷、柚皮苷溶出量均有明顯增多。四逆散凍干粉中甘草酸溶出量較之在甘草凍干粉中也有一定增加。在210nm波長下四逆散凍干粉色譜圖中3、8、16、20和23號成分峰來自于甘草,其中20號成分峰為甘草酸峰,210nm波長下的8號峰與240nm波長下的7號峰保留時間及紫外吸收光譜圖相同,屬同一成分;210nm波長下的16號峰與240nm波長下的14號峰為同種物質(zhì)。3指數(shù)值的測定根據(jù)以往文獻報道,由于柴胡皂苷a、d不穩(wěn)定在提取過程發(fā)生轉(zhuǎn)化,致使在四逆散凍干粉色譜圖中未出現(xiàn)柴胡皂苷a、d色譜峰,對于二者的轉(zhuǎn)化過程有待進一步研究。指紋圖譜測定結(jié)果表明,各共有色譜峰的存在與否能夠客觀地反映四逆散凍干粉的內(nèi)在質(zhì)量;四逆散凍干粉的工藝穩(wěn)定可控,能夠保證所制四逆散凍干粉的質(zhì)量均一可靠,為四逆散凍干粉的質(zhì)控提供了