水華束絲藻粗提物對(duì)小鼠血液生物力學(xué)的影響

水華束絲藻粗提物對(duì)小鼠血液生物力學(xué)的影響

近年來(lái)，赤潮發(fā)生在世界附近的靠海海域。赤潮生物產(chǎn)生的海上毒素通過(guò)海上食物網(wǎng)絡(luò)而導(dǎo)致各種貝類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)和沿海居民的家人、家人和家人，造成巨大的海洋經(jīng)濟(jì)損失。而各種海洋生物的食用價(jià)值日愈為人們所認(rèn)可,逐漸進(jìn)入普通家庭,越來(lái)越多的人也進(jìn)入這一毒素食物網(wǎng),人們誤食有毒貝類(lèi)而死亡的報(bào)道已屢見(jiàn)不鮮。在這些海洋毒素中,麻痹性貝毒可說(shuō)是最常見(jiàn)、危害也最大的一種。麻痹性貝毒是石房蛤毒素(Saxitoxin,STX)及其衍生物共20多種毒性、毒量均不同的毒素的統(tǒng)稱(chēng),它們的毒理是相同的,只是毒性有差異。在這些毒素中,STX和新石房蛤毒素(neo-STX)較為穩(wěn)定,且毒力較高;而膝溝藻毒素(GTX)等在一定的溫度和酸度條件下較易發(fā)生轉(zhuǎn)化,且毒性比前兩者弱,故不利于毒素的研究。藍(lán)藻水華束絲藻(Aphanizomenonflos-aquae)是一種較易培養(yǎng)的淡水藻,其所分泌的麻痹性貝毒主要是STX毒素和neo-STX毒素,且含量很高,適于作麻痹性貝毒研究的毒素材料來(lái)源。目前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者在STX對(duì)動(dòng)物心血管和血壓的作用等方面做過(guò)不少的研究報(bào)道。為了保持毒性,麻痹性貝毒一般都在酸性條件下提取和保存,以及在酸性條件下進(jìn)行毒力測(cè)定。所以,研究毒素和酸對(duì)動(dòng)物的毒性作用關(guān)系有其必要性。本文就STX和酸性生理鹽水對(duì)小白鼠血液若干生理指標(biāo)的影響進(jìn)行初步的探討,以便為STX中毒的診斷和防治提供幫助,并為今后的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料表面水華束絲藻由暨南大學(xué)水生生物研究所提供。健康無(wú)孕、18~22克左右的雌性昆明小白鼠購(gòu)自暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物廠。1.2方法1.2.1培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)程序培養(yǎng)基采用Mahmood所采用的BG-11培養(yǎng)基。5L血清瓶,以氣泵通空氣,每天搖瓶1次。培養(yǎng)溫度24℃~25℃,培養(yǎng)瓶表面光強(qiáng)在培養(yǎng)初期為70~90μmol/(m2·s)后期為150~200μmol/(m2·s)。培養(yǎng)20天后離心收集藻細(xì)胞。1.2.2提取毒素細(xì)胞經(jīng)離心收集后,加0.1mol乙酸,凍融4次,然后離心得上清液,作為毒素粗提液。1.2.3小鼠毒副反應(yīng)總毒素含量ld50采用AOAC小鼠生物檢測(cè)法。腹腔注射1ml適當(dāng)稀釋的粗提物,使小鼠死亡時(shí)間為5~7min,然后根據(jù)Sommer氏表,確定粗提物的毒性,以小鼠單位MU表示,1MU定義為15分鐘使20g小白鼠中毒致死所需的毒素量?？瞻讓?shí)驗(yàn):取2只小白鼠,在其腹腔處注入1ml鹽酸溶液(pH3.55),1小時(shí)內(nèi)無(wú)死亡。毒性實(shí)驗(yàn):根據(jù)以往預(yù)試驗(yàn),取0.3mlSTX提取液,用HCl(pH3.55)稀釋至6ml(pH4.72)。取5只小白鼠,于每只腹腔注射1mlSTX稀釋液,觀察記錄每只小白鼠的死亡時(shí)間,死亡判定以最后一次喘息為準(zhǔn)。1.2.4小鼠血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)取18~22g小白鼠64只,分成9個(gè)組。其中,4個(gè)組的小白鼠分別腹腔注射1mlpH5.3的生理鹽水(對(duì)照組);4個(gè)組的小鼠分別腹腔注射1ml0.5MU/ml生理鹽水STX毒素(pH5.3),作為染毒組;1個(gè)組做空白組(不注射)。在30min,6h,12h,24h后,分別對(duì)一組染毒小鼠和一組對(duì)照組小鼠進(jìn)行摘眼球采血,空白組在同樣條件下用相同方法進(jìn)行采血。用AC970型全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀對(duì)所采血樣進(jìn)行分析。2結(jié)果2.1小鼠毒力大小及死亡癥狀所對(duì)應(yīng)的sommer表t采取AOAC小鼠生物檢測(cè)法,腹腔注射1ml適當(dāng)稀釋的藻毒素提取液,使小鼠死亡時(shí)間落在4~8min內(nèi),觀察其死亡癥狀,根據(jù)sommer表?yè)Q算毒力大小。查sommer表可知,小白鼠平均死亡時(shí)間為306秒所對(duì)應(yīng)的鼠單位是約1.89MU;而平均體重為19.92克時(shí)對(duì)應(yīng)的鼠單位校正系數(shù)約為1.000。所以,1mL該STX提取液的毒素含量為:鼠單位×稀釋倍數(shù)=1.89Mu×(6ml/0.3ml)=37.8MU。2.2紅細(xì)胞計(jì)數(shù)采用單因素F測(cè)定,所得數(shù)據(jù)見(jiàn)表2和表3。其中的縮寫(xiě),RBC:紅細(xì)胞計(jì)數(shù),HGB:血紅蛋白計(jì)數(shù),HCT:紅細(xì)胞壓積,MCV:紅細(xì)胞平均容積,MCH:紅細(xì)胞平均血紅蛋白,MCHC:紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度,PLT:血小板計(jì)數(shù),WBC:白細(xì)胞計(jì)數(shù),LYM:淋巴細(xì)胞,MID:中性分葉細(xì)胞,GRA:顆粒細(xì)胞。2.3差無(wú)明顯差異時(shí)的單尾概率分別對(duì)0.5,6,12,和24h后的酸性對(duì)照組和染毒組的對(duì)應(yīng)生理指標(biāo)進(jìn)行兩組數(shù)據(jù)的單因素F測(cè)定,所得方差無(wú)明顯差異時(shí)的單尾概率列于表2中。將在腹腔注射0.5MU/mlSTX(pH5.3)或0.9%NaCl(pH5.3)后沒(méi)有顯著影響的紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)和有顯著或極其顯著變化的紅細(xì)胞壓積(HCT)、白細(xì)胞(WBC)、中性分葉細(xì)胞(MID)和顆粒細(xì)胞(GRA)按0.5、6、12、24h的順序制成表3。3stx分次注射毒性試驗(yàn)從表2中,我們可看出:0.5h后,酸性生理鹽水對(duì)照組小白鼠的白細(xì)胞數(shù)量與染毒組小白鼠的白細(xì)胞數(shù)量間有顯著差異;其中,中性分葉細(xì)胞的數(shù)量則有極其顯著差異,其余各指標(biāo)均無(wú)顯著差異。6小時(shí)后,所有指標(biāo)無(wú)顯著差異。12h后,酸性生理鹽水對(duì)照組小白鼠的紅細(xì)胞壓積與染毒組小白鼠的紅細(xì)胞壓積之間有顯著差異。24h后,兩組小白鼠間的各指標(biāo)中只有GRA有極其顯著差異。從數(shù)據(jù)中,我們至少可以得出兩點(diǎn):第一,0.5MU/mlSTX在腹腔注射小白鼠后的0.5、6、12、24h這幾個(gè)時(shí)間段除了對(duì)紅細(xì)胞壓積(HCT,見(jiàn)表3)有顯著影響外,對(duì)小白鼠的紅細(xì)胞,血紅蛋白,血小板等沒(méi)有顯著影響,然而,卻引起白細(xì)胞的數(shù)量發(fā)生顯著或極其顯著的變化;第二,在毒素注射后的不同時(shí)間,白細(xì)胞數(shù)量的變化程度和變化趨勢(shì)是不一樣的,且?guī)追N占優(yōu)勢(shì)地位的白細(xì)胞(如,LYM,MID,GRA等)占總白細(xì)胞數(shù)量的百分比在發(fā)生改變。這些變化從表3中可看出。從表3的RBC和HGB看來(lái),雖然不同時(shí)間段的數(shù)據(jù)有較大差異(染毒組RBC:9.196×1012/L,7.925×1012/L,8.523×1012/L,8.038×1012/L,8.43×1012/L;染毒組HGB:148.2g/L,131.4g/L,139.7g/L,135g/L,139.3g/L),但酸性生理鹽水對(duì)照組和染毒組之間卻幾乎一樣。換句話(huà)來(lái)說(shuō),至少對(duì)于0.5MU/mlSTX,在本實(shí)驗(yàn)所測(cè)的幾個(gè)時(shí)間段,導(dǎo)致這些數(shù)據(jù)不同時(shí)期的變化的原因是酸中毒(0.9%NaCl,pH5.3),而不是STX(0.5MU/ml,pH5.3)中毒。在表3的WBC、MID和GRA中,有兩個(gè)共同的特別顯著的地方:其一,在0.5h時(shí)間段,染毒組與酸性生理鹽水對(duì)照組之間的差距特別明顯,后者大多是前者的一倍以上(WBC數(shù)量,STX組:1.93×109/L,HCl組:4.23×109/L;MID數(shù)量,STX組:0.29×109/L,HCl組:1.02×109/L;GRA數(shù)量,STX組:0.11×109/L,HCl組:0.689×109/L),而其它時(shí)間段則不明顯;其二,每一個(gè)染毒組的數(shù)據(jù)幾乎都是在0.5h時(shí)間段降到最低點(diǎn),其后慢慢回升,而酸性生理鹽水對(duì)照組的數(shù)據(jù)都是在12h時(shí)間段才降到最低(WBC降到2.90×109/L;MID降到0.31×109/L;GRA降到0.06×109/L),然后再恢復(fù)到正常水平。對(duì)以上結(jié)果分析,pH5.3,0.5MU/ml的STX進(jìn)入小白鼠血液后,酸和STX毒素分別通過(guò)神經(jīng)體液等調(diào)節(jié)系統(tǒng)影響各血細(xì)胞生理指標(biāo),在0.5h內(nèi),主要是STX毒素發(fā)揮毒理效應(yīng),隨著STX毒素分布到各組織器官及通過(guò)排泄系統(tǒng)排出體外,其毒性效應(yīng)也逐漸減弱;而酸則在12h時(shí)發(fā)揮最大毒力效應(yīng),隨后也逐漸減弱。從表3中,我們還可看到,在12h以前,每個(gè)時(shí)間段的中毒組數(shù)據(jù)都要比酸性生理鹽水對(duì)照組數(shù)據(jù)小,而24h的數(shù)據(jù)則稍大。其原因可能是,12h之前STX毒素的毒力作用占主導(dǎo),而24h則是酸中毒占主導(dǎo)。當(dāng)然,這個(gè)結(jié)果是基于0.5MU/mlSTX毒性和pH5.3酸度的基礎(chǔ)之上的,不同的STX毒量和酸度會(huì)使這種關(guān)系發(fā)生移動(dòng),這有待于進(jìn)一步的研究。經(jīng)過(guò)精確的定量研究,確定STX毒量和酸度與染毒深淺之間的數(shù)量關(guān)系,再輔于血?dú)庵笜?biāo)與染毒深淺之間的數(shù)量關(guān)系,或許可作為一種簡(jiǎn)易、快速的STX中毒臨床試驗(yàn)方法。據(jù)目前所知,動(dòng)物STX中毒死亡的