不同運動方式和制動狀態(tài)下大鼠腓腸肌p-ak蛋白表達的變化

不同運動方式和制動狀態(tài)下大鼠腓腸肌p-ak蛋白表達的變化

骨肌肉合成改善的信號通道主要集中在igf-1的pi3k和gat-m-s通道上，這些運動刺激了igf-1的發(fā)現(xiàn)，促進了act（ser373）的激活。激活的agt使ser2448磷酸，促進蛋白質(zhì)合成。另一方面,肌肉蛋白質(zhì)降解可以通過四種途徑來完成,包括溶酶體途徑、calpain途徑、caspase途徑和泛素蛋白酶體途徑,而泛素蛋白酶體途徑是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的主要調(diào)節(jié)者。肌肉萎縮時,泛素蛋白酶系統(tǒng)的多種組分表達都有升高,而泛素蛋白連接酶E3s是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究顯示,兩種E3與肌萎縮密切相關(guān),分別是MAFbx/Atrogin-1和MuRF1。有研究顯示,MuRF1和MAFbx兩泛素蛋白連接酶(肌肉蛋白降解的重要標(biāo)志)在肌肉出現(xiàn)萎縮的過程中表達增加。FOXO家族是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,對細胞增殖、細胞凋亡等生理過程具有重要調(diào)節(jié)作用,肌萎縮時,PI3K/Akt通路受到抑制,而PI3K/Akt可對FoxOs特定的氨基酸位點進行磷酸化/去磷酸化的調(diào)控。當(dāng)去磷酸化的FoxOs移入細胞核內(nèi),骨骼肌中的MuRF1和MAFbx表達上調(diào),MuRF1和MAFbx通過編碼E3泛素連接酶,從而加速蛋白降解,引起骨骼肌萎縮;過表達Akt會抑制FOXO和MAFbx的表達,當(dāng)FOXO受抑制時,MAFbx表達下降,干擾肌萎縮的發(fā)生。由此可見,FOXO在肌萎縮發(fā)生中起重要作用。近幾年的研究表明,該家族成員FoxO1在骨骼肌的分化、生長與代謝過程中扮演重要角色。IGF-1/PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不僅可以直接使蛋白合成增加,而且磷酸化狀態(tài)下的Akt,可以通過抑制FoxOs的轉(zhuǎn)錄而阻止MuRF1的表達,進一步加大骨骼肌肥大的發(fā)生效果。本文利用耐力訓(xùn)練、離心訓(xùn)練、后肢懸垂三種模型,研究不同運動方式對骨骼肌代謝的影響,通過對AKT、FoxO1、MuRF1等因子的研究,探討骨骼肌蛋白質(zhì)合成/降解的分子機制,從而為與運動相關(guān)的骨骼肌形態(tài)、機能改變的機理研究提供實驗依據(jù)。1材料和方法1.1實驗動物中心清潔級雄性SpragueDawley(SD)大鼠40只,體重(200±10)g,約8周齡,購自大連市大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。飼養(yǎng)條件:溫度(20±2)°C、分籠飼養(yǎng)、自然晝夜節(jié)律變化光照、國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料。1.2大鼠的運動方案動物實驗方案獲得遼寧師范大學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。將大鼠隨機分為4組:對照組、耐力訓(xùn)練組、離心訓(xùn)練組、后肢懸垂組。每組10只。對照組:該組大鼠作為對照,不參加運動訓(xùn)練,自由飲食。耐力訓(xùn)練組:將跑臺坡度設(shè)置為0°,第1~2周為漸增負荷的適應(yīng)性訓(xùn)練,第3~12周正常訓(xùn)練,跑速為30m/min,60min/次,為中等運動強度,相當(dāng)于70%~80%VO2max、1次/d,6d/周。后肢懸垂組:參照Chen等的大鼠尾部懸吊方案建立懸垂模型,使大鼠始終能夠保持低頭位(頭部與地面成30o夾角),并且前肢能夠自由活動;該組大鼠用50cm×50cm×50cm的鼠籠單獨飼養(yǎng),第1~8周大鼠放在籠子里飼養(yǎng)不參加活動,不做任何處理,第9~12周進行為期4周的后肢懸垂;在后肢懸垂實驗中途,有2只鼠出現(xiàn)不適反應(yīng),被淘汰,最后本組剩下8只鼠。離心訓(xùn)練組:參照Bedford等的運動負荷方案:第1、2周為適應(yīng)性訓(xùn)練,運動強度逐漸增加(跑臺坡度由0o到-16o,跑臺速度由10m/min逐漸增加到16m/min,訓(xùn)練時間逐漸增加),第3~12周進行正式訓(xùn)練,跑速16m/min,坡度-16o,45min/次,6d/周。為避免出現(xiàn)急性效應(yīng),大鼠停止訓(xùn)練2d后,在其處于禁食的狀態(tài)進行實驗取材。腹腔注射20%的氨基甲酸乙酯(俗稱烏拉坦)進行麻醉。腹主動脈取血。迅速取出大鼠腓腸肌,立即儲于液氮中保存?zhèn)溆谩?.3免疫、免疫藥物和抗PMSF、EDTA、溴酚藍、TEMED、EGTA購置于AMRESCO公司;TritonX-100、BSA、Glycerol、Acrlamide-bis購置于ScientificResearchSpecial公司;APS、SDS、DTT、甲苯胺藍、Tris-Base、Glycine購置于Biosharp公司;丙烯酰胺購置于NOVON公司。其它為國產(chǎn)分析純。實驗用抗體:抗兔FoxO1多克隆抗體(18592-1-AP,Proteintech公司);抗兔p-Akt單克隆抗體(BS4007,Liawaild公司);抗兔MuRF1多克隆抗體(55456-1-AP,Proteintech公司);抗兔β-actin(C4)單克隆抗體(sc-47778,SantaCruz公司);免疫組化用羊抗兔二抗(SP-9001,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。Westernblot用羊抗兔二抗(31460,Thermo公司)。1.4免疫組織化學(xué)染色法dab免疫組化:一抗抗兔單克隆抗體p-Akt參照預(yù)實驗結(jié)果按1:50稀釋,室溫靜置備用。陰性對照用PBS代替一抗。組織切片二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化;3%H2O2溶液室溫孵育20min;0.01mol/LCB緩沖液(pH6.0)滴加組織,微波修復(fù)100°C(P6火力)25min,自然冷卻,PBS常溫浸泡3min×3次;室溫下滴加胎牛血清(Gibco公司)封閉15min;37°C環(huán)境結(jié)合一抗1h,4°C孵育過夜,PBS浸泡3min×3次;加二抗,37°C孵育20min,PBS浸泡3min×3次;酶標(biāo)羊抗兔二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)與一抗在37°C下結(jié)合20min,PBS浸泡3min×3次;新鮮配制DAB顯色;蘇木精復(fù)染胞核,透明并封固。免疫組化結(jié)果根據(jù)陽性細胞分布、陽性細胞數(shù)和染色強度綜合判斷,以細胞膜上清晰的黃褐色顆粒為判定陽性標(biāo)準(zhǔn)。用Imagepro6.0軟件對切片在400倍下拍照獲得的圖像進行分析,測得不同切片的光密度值。1.5染色、照片的制備石蠟切片脫蠟至水;蘇木素染色2min;流水返藍10min;伊紅染色1min;流水沖洗2min;梯度乙醇脫水、透明;封片。將染色后切片在400倍下拍照獲得圖像。用Imagepro6.0軟件對切片在400倍下拍照獲得的圖像進行分析,測量出細胞的平均橫截面積。1.6上樣和上樣制備取腓腸肌稱重、剪碎,每克組織加3mLRIPA裂解液[NaCl終濃度0.15mol/L,TritonX-100終濃度1%,Deoxycholow脫氧膽酸鈉終濃度1%,SDS終濃度0.1%,Tris-HCl(pH=7.4)終濃度10mmol/L,使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF,使PMSF終濃度為1mmol/L],勻漿,靜置40min充分裂解,10000r/min離心10min,取上清,Bradford法定蛋白,分裝,以上操作均在4oC進行,蛋白分裝后置于-80oC冰箱儲存?zhèn)溆?。電泳時,取80μg總蛋白配制成上樣體系,置95°C沸水中5min,上樣前以3000r/min離心5min。配制8%分離膠(MuRF1、FoxO1)、12%分離膠(β-actin),4%濃縮膠,220V電壓進行電泳,半干轉(zhuǎn)膜儀220V轉(zhuǎn)移90min將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上,封閉60min后加入一抗(MuRF11:500、FoxO11:400、β-actin1:1000),4°C孵育過夜,PBST洗膜后用不同濃度二抗室溫孵育60min,ECL顯色、定影,凝膠成像系統(tǒng)進行拍照,GelPro32圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果,將每個條帶與相應(yīng)樣品的β-actin條帶光密度值進行比較,計算出目的條帶的相對含量值。1.7統(tǒng)計學(xué)處理實驗數(shù)據(jù)用mean±SD表示,采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行多因素方差分析統(tǒng)計,兩兩比較用LSD法或Tamhane’sT2法(方差不齊),P<0.05顯示為有統(tǒng)計學(xué)差異。2結(jié)果2.1大鼠體重和體重的變化由圖1可見,從第9周開始,各組大鼠體重的改變出現(xiàn)了差異,至第12周時,耐力訓(xùn)練組、離心訓(xùn)練組和后肢懸垂組大鼠體重均低于對照組,且后肢懸垂組體重最小。離心訓(xùn)練組和后肢懸垂組大鼠腓腸肌重量較對照組均顯著下降(P<0.05或P<0.01),耐力訓(xùn)練組與對照組比較無顯著性差異(表1)。2.2組患者截面積、企業(yè)被截面積、關(guān)于被壓迫力對比見表1由圖2所示,離心訓(xùn)練和后肢懸垂組腓腸肌細胞橫截面積顯著低于對照組(P<0.05或P<0.01),耐力訓(xùn)練組與對照組比較無顯著性差異。肌細胞橫斷面積的變化與腓腸肌重量的改變相一致。2.3提高了腓腸肌p-akt蛋白表達由圖3顯示,和對照組相比,耐力訓(xùn)練和離心訓(xùn)練這兩種運動方式均極顯著提高了大鼠腓腸肌p-Akt蛋白表達(均P<0.01),而制動的模型后肢懸垂沒有引起p-Akt表達的明顯改變。2.4在氧漂后離心運動和抗性訓(xùn)練中明顯提高merf1蛋白表達由圖4顯示,和對照相比,后肢懸垂明顯增加了大鼠腓腸肌MuRF1的表達(P<0.05),離心運動極顯著提高了MuRF1表達(P<0.01),耐力訓(xùn)練沒有顯著改變MuRF1蛋白表達。如圖4所示,耐力訓(xùn)練非常明顯降低了大鼠腓腸肌FoxO1蛋白表達(P<0.01);而后肢懸垂和離心運動均顯著提高了腓腸肌FoxO1表達(P<0.01)。3離心運動與免疫骨骼肌對運動訓(xùn)練等相關(guān)刺激有高度的敏感性,運動的刺激能夠引起骨骼肌蛋白質(zhì)的合成與分解代謝發(fā)生改變,表現(xiàn)在肌肉質(zhì)量和橫截面積大小以及重量的變化上。耐力訓(xùn)練可選擇性激活A(yù)MPK,活化的AMPK能磷酸化激活TSC2,并促進TSC1/2復(fù)合物的形成,后者通過抑制Rheb的活性,間接抑制mTOR的活性,從而減少骨骼肌蛋白質(zhì)的合成。本研究結(jié)果顯示,耐力訓(xùn)練組腓腸肌重量較對照組無顯著差異,這可能是由于耐力訓(xùn)練促進Akt磷酸化,同時激活了AMPK兩個信號分子,從而對mTOR的作用相互抵消,使得耐力訓(xùn)練組與對照組無顯著差異。本研究結(jié)果顯示耐力訓(xùn)練引起p-Akt的蛋白表達顯著升高,這驗證了上述推斷。而耐力訓(xùn)練組大鼠體重增幅低于對照組大鼠,這可能是長期進行耐力訓(xùn)練,使體內(nèi)脂肪減少,從而使體重較輕的緣故。Hyldahl等報道,大鼠經(jīng)離心訓(xùn)練以后,骨骼肌的蛋白降解率均有所增加。與這一結(jié)果一致,在本研究中,離心訓(xùn)練組腓腸肌重量及細胞橫截面積呈現(xiàn)顯著下降表現(xiàn)為離心訓(xùn)練組大鼠在12周時的體重增幅低于對照組。本研究結(jié)果顯示,離心訓(xùn)練組和后肢懸垂組均引起了泛素蛋白酶途徑活化。另外,連續(xù)的離心運動訓(xùn)練還可導(dǎo)致骨骼肌中鈣依賴性蛋白酶(Calpain)含量的增加,Calpain可水解多種骨骼肌骨架蛋白,進一步導(dǎo)致肌肉結(jié)構(gòu)和功能改變以及肌肉損傷,引起肌肉重量及橫斷面積的減少。另外,研究提示,在后肢懸垂情況下骨骼肌蛋白分解較蛋白合成更容易,后肢懸垂減少肌纖維蛋白合成率約為27%~40%。上述過程也可能導(dǎo)致離心訓(xùn)練組和后肢懸垂組大鼠在12周時的體重增幅低于對照組。Ma等研究1次耐力運動對Akt-mTOR信號通路的影響,觀察到AktSer473磷酸化水平在運動后各時間點均顯著升高。Cao等的研究顯示,持續(xù)7周的耐力訓(xùn)練可以使p-PKB(p-Akt)蛋白表達顯著升高,同時PKB(Akt)基因表達也顯著升高。本研究結(jié)果和上述研究一致,顯示經(jīng)過12周耐力訓(xùn)練,大鼠腓腸肌p-Akt表達顯著升高。此外,有研究顯示,低強度有氧運動能夠改善IGF-1/PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的磷酸化水平。本實驗中耐力訓(xùn)練組腓腸肌FoxO1蛋白表達極顯著低于對照組,而此組MuRF1與對照組無顯著性差異,表明耐力訓(xùn)練方式對主導(dǎo)萎縮的因子無影響。驗證了“激活狀態(tài)下的Akt可以通過抑制FoxO1的轉(zhuǎn)錄而阻止MuRF1表達”的論斷。本實驗中,離心運動組p-Akt表達顯著增加。出現(xiàn)這一結(jié)果的可能原因為,離心運動導(dǎo)致骨骼肌損傷,損傷修復(fù)過程激活了IGF-1/PI3K/Akt等蛋白合成的信號通路,使p-Akt表達顯著增加。Eliasson等比較了離心運動和向心運動對Akt/mTORCI/p70S6K通路激活的影響,發(fā)現(xiàn)離心運動比向心運動能更有效地激活這一通路,并認為這是由于離心運動能使肌纖維產(chǎn)生更大的張力,對肌肉給予了更大的刺激。Roschel等研究了不同速度的離心運動對Akt/mTOR/p70S6K通路的影響,觀察到完成了5組重復(fù)8次的離心展膝練習(xí)2h后Akt和p70S6K磷酸化表達均顯著提高,并沒有顯示出速度差異性,因此認為影響蛋白合成的主要因素是肌肉所承受的張力而非速度。在本研究中,離心訓(xùn)練組腓腸肌FoxO1和MuRF1表達均顯著升高,說明FoxO1表達升高可能激活了MuRF1的表達,表現(xiàn)在形態(tài)學(xué)指標(biāo)的肌纖維橫截面積也顯著減小,考慮到離心訓(xùn)練組p-Akt表達同樣顯著增加,本文結(jié)果提示:長期的離心運動可能同